Eine Technik zur Isolierung von Zellkernen aus nicht-neuronalen Zellen im Gyrus dentatus des Hippocampus

Gyrus dentatus aus einem Mäusegehirn in einem kalten Homogenisierungspuffer entnehmen.

Dissoziieren mechanisch, um Neuronen, Gliazellen und Stammzellen freizusetzen.

Das milde Detergens des Puffers permeabilisiert die Zellen und setzt Zellkerne und andere Organellen frei.

Filtern Sie das Homogenat, um Gewebereste zu entfernen. Zentrifugieren Sie dann, entfernen Sie die Organellen und resuspendieren Sie sie im Homogenisierungspuffer, um alle intakten Zellen zu lysieren.

Zentrifugieren Sie erneut, entfernen Sie den Überstand mit den freigesetzten Organellen und resuspendieren Sie die Zellkerne in einem Waschpuffer.

Filtrieren Sie, um Schmutz zu entfernen, zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand.

Führen Sie eine fluoreszierende DNA-Färbung ein, um alle Zellkerne zu markieren, und einen Fluorophor-konjugierten Antikörper, der an das neuronale Kernantigen (NeuN) bindet und die Neuronenkerne markiert

Identifizieren Sie mithilfe der fluoreszenzaktivierten Kernsortierung Aggregate mit höherer Fluoreszenzintensität der DNA-Färbung und höheren Streueigenschaften, indem Sie die einzelnen Kerne trennen.

Analysieren Sie die einzelnen Kerne, trennen Sie die NeuN-positiven Neuronalkerne und isolieren Sie die NeuN-negativen Kerne, die zu den Gliazellen und Stammzellen gehören.

Homogenisieren Sie das Gewebe mit 10 Zügen des losen A-Stößels, gefolgt von 15 Zügen des engen B-Stößels. Das Homogenat in ein vorgekühltes 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Spülen Sie den Dounce Homogenisator mit 1 Milliliter kaltem HB und kombinieren Sie ihn mit demselben Röhrchen.

Geben Sie 3 Milliliter HB in das 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie 5 Minuten lang auf Eis. Mischen Sie diese Kernsuspension zweimal, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen. Befeuchten Sie die 70-Mikrometer-Siebkappe mit 0,5 Millilitern HB über einem 50-Milliliter-Reagenzglas vor. Dann seihen Sie die Zellkernsuspension ab, bevor Sie das Zellsieb mit 0,5 Millilitern HB waschen.

Entfernen Sie anschließend das Zellsieb und zentrifugieren Sie das Reagenzglas in einer Schwenkeimerzentrifuge bei 500 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 4 Millilitern HB mit einer P1000-Pipette.

Nach fünf Minuten Inkubation auf Eis zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 3 Millilitern Waschmedium. Verwenden Sie 0,5 Milliliter Waschmedium, um eine 35-Mikrometer-Siebkappe über einem 50-Milliliter-Reagenzglas vorzubefeuchten. Anschließend seihen Sie die Kernsuspension ab, indem Sie jeweils 0,5 Milliliter Suspension mit der P1000-Pipette pipettieren.

Nachdem Sie den Siebdeckel mit 0,5 Millilitern Waschmittel gewaschen haben, legen Sie den Schlauch auf Eis. Das Filtrat wird in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 500 g zentrifugiert. Der Überstand wird entsorgt und das Pellet in 3 Millilitern Waschmedium wieder suspendiert.

Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Waschmedium mit dem Maus-Anti-Neu und dem AlexaFlour488-konjugierten Antikörper und 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI. Inkubieren Sie die Reaktion 45 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.

Für die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung oder FANS übertragen Sie die immungefärbte Kernsuspension in ein 5-Milliliter-Reagenzglas und legen Sie es bis zum Beginn des Durchflusszytometrieverfahrens auf Eis.

Wirbeln Sie die Proben drei Sekunden lang mit milder Intensität vor, bevor Sie die Röhrchen in das FACS-Gerät einsetzen.

Um die Daten aus der Suspension der Färbekerne zu erhalten, stellen Sie die Gates in der DAPI-Höhe und im DAPI-Bereich so ein, dass die Zelltrümmer und die aggregierten Kerne ausgeschlossen werden. Setzen Sie dann die Gates im logarithmischen Seitenstreu- oder SSC-Bereich und im logarithmischen Vorwärtsstreuungs- oder FSC-Bereich, um die einzelnen Kerne von den verbleibenden DAPI-gefärbten Aggregaten oder Zelltrümmern zu trennen.

Isolieren Sie dann die NeuNAF488-negative Population, indem Sie die Tore für den Anti-NeuNAF488- und FSC-Bereich setzen.

Nach der Analyse wird die Anti-NeuNAF488-negative Population in ein 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen sortiert, das mit 50 Mikrolitern Waschmedium gefüllt ist.