Isolierung von Mikroglia aus demyelinisierenden Läsionen des Mausgehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Präparieren Sie gefärbte demyelinisierende Läsionen aus dem Corpus callosum eines Mausgehirns.

Diese Läsionen enthalten hirnresidente Mikroglia, die das Zelloberflächenintegrin CD11b exprimieren.

Entnehmen Sie das Gewebe und fügen Sie eine Lösung hinzu, die ein proteolytisches Enzym und DNase enthält.

Das Enzym baut die extrazelluläre Matrix ab, während DNase freie DNA abbaut.

Fügen Sie kalten Puffer hinzu und filtrieren Sie die Suspension durch ein Sieb, um Zellklumpen zu entfernen.

Zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die pelletierten Zellen in einem Dichtegradientenmedium resuspendieren.

Mit Puffer und Zentrifuge überlagern, um verbleibende Ablagerungen in den oberen Schichten aufzufangen; intakte Zellen setzen sich am Boden ab.

Entfernen Sie die Ablagerungen und suspendieren Sie die Zellen in einem Puffer

Fügen Sie Anti-CD11b-Magnetkügelchen hinzu, um die Mikroglia zu markieren.

Laden Sie die Zellen auf eine Säule mit ferromagnetischen Kugeln, die im Magnetfeld des Magnetabscheiders platziert sind.

Unter dem äußeren Magnetfeld werden die kügelchengebundenen Mikroglia in der Säule zurückgehalten, während ungebundene Zellen hindurchströmen.

Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld. Fügen Sie einen Puffer hinzu, um die Mikroglia zu eluieren.

Beginnen Sie mit der Mikrodissektion der mit neutralem Farbstoff markierten Läsionen um das Corpus callosum herum unter einem Stereomikroskop. Zentrifugieren Sie das präparierte Gewebe 30 Sekunden lang bei 300 x g, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Enzymmix 1 und Enzymmix 2 in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius vorheizen. Geben Sie dann 1.950 Mikroliter der vorgewärmten Enzymmischung 1 zu einer Probe und verdauen Sie sie 5 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie 30 Mikroliter der vorgewärmten Enzymmischung 2 hinzu und mischen Sie vorsichtig.

Geben Sie nach der Verdauung 4 Milliliter kaltes PBS in das Röhrchen und schütteln Sie es leicht. Zentrifugieren Sie die Gewebeproben bei 300 x g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand langsam und vollständig. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1.550 Mikrolitern kaltem PBS. Fügen Sie 450 Mikroliter der kalten Lösung zur Entfernung von Schmutz hinzu und mischen Sie sie gut.

Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Mischung sehr langsam und vorsichtig mit 2 Millilitern kaltem PBS zu überlagern. Zentrifugieren Sie, die Mischung und suchen Sie dann nach den 3 Schichten. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die 2 oberen Schichten vollständig abzusaugen, und füllen Sie das Röhrchen bis zu 5 Milliliter mit Kaltladepuffer. Drehen Sie das Rohr vorsichtig 3 Mal um.

Als nächstes wird nach der Zentrifugation und Aspiration des Überstands das Zellpellet mit 90 Mikrolitern Ladepuffer resuspendiert und 10 Mikroliter CD11b-Kügelchen hinzugefügt. Gut mischen und 15 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie 1 Milliliter des Ladepuffers hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie die Flüssigkeit mit einer 1000-Mikroliter-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten bei 4:00 Grad Celsius und saugen Sie den Überstand vollständig an, um die ungebundenen Kügelchen zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern des Ladepuffers und platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur positiven Selektion in das Magnetfeld. Spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern des Ladepuffers, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung auf der Grundlage des Herstellerprotokolls zu gewährleisten.

Tragen Sie die Zellsuspension auf die MS-Säule auf und verwerfen Sie den Durchfluss mit den unmarkierten Zellen. Fügen Sie 500 Mikroliter des Ladepuffers hinzu, um die Säule zu waschen, und entfernen Sie sie aus dem Abscheider. Stellen Sie die Säule auf ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 1 Milliliter des Ladepuffers in die Säule. Schieben Sie schließlich den Kolben an den unteren Rand der Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen.