Isolierung von Immunzellen aus Aderhautplexusen der Maus

Positionieren Sie die Rückenseite des Gehirns einer Maus nach oben.

Trennen Sie unter einem Mikroskop die Gehirnhälften. Ziehe die Hirnrinde und dann den Hippocampus weg, um die Seitenventrikel und den dritten Ventrikel freizulegen.

Sammeln Sie zwei laterale Aderhautplexus. Dabei handelt es sich um immunzellreiche Gehirnstrukturen, die die Seitenventrikel wie ein langer Schleier auskleiden.

Sammeln Sie den dritten Ventrikelplexus choroideus, eine kurze Struktur mit einer körnigen Oberfläche.

Löse das Kleinhirn, um den vierten Ventrikel freizulegen.

Sammeln Sie den vierten Ventrikelplexus choroideus, eine lange kugelförmige Struktur mit einer körnigen Oberfläche.

Legen Sie alle Plexus choroideus in ein Röhrchen mit gepufferter Kochsalzlösung, um die Integrität des Gewebes zu erhalten.

Eine Verdauungsenzymlösung zugeben und unter Rühren inkubieren.

Das Enzym baut die extrazelluläre Matrix auf und lockert die Zellen.

Fügen Sie einen geeigneten Puffer hinzu, um das Enzym zu inaktivieren.

Zentrifuge, um die Zellen abzusetzen. Der Überstand wird verworfen und die Zellen zur weiteren Analyse in einem frischen Puffer resuspendiert.

Positionieren Sie zunächst das von einer C57 Black 6 Maus mit der Rückenseite nach oben präparierte Gehirn in einer Petrischale und platzieren Sie die Schale unterhalb der Objektive der Binokularlupen. Während Sie das Gehirn mit einer Pinzette an Ort und Stelle halten, führen Sie die beiden Enden einer anderen Pinzette durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären ein.

Ziehen Sie mit der Pinzette die Rinde mit dem Kallosum und dem Hippocampus vom Septum weg, wodurch der Seitenventrikel und ein Teil des dritten Ventrikels freigelegt werden. Identifizieren Sie den Plexus choroideus lateralis als einen langen Schleier, der den lateralen Ventrikel auskleidet und an beiden Enden aufbläht. Entnehmen Sie dann mit zwei Enden einer dünnen Pinzette den Plexus choroideus lateralis. Achten Sie darauf, den dreieckigen hinteren Teil zu sammeln, der von der hinteren Falte des Hippocampus verdeckt wird.

Ziehen Sie als nächstes den Kortex mit dem Corpus callosum und dem Hippocampus der kontralateralen Hemisphäre vom Septum weg, um den gesamten dritten Ventrikel und den gegenüberliegenden lateralen Ventrikel freizulegen. Entnehmen Sie mit einer feinen Pinzette den dritten Plexus choroideus, der als kurze Struktur mit körniger Oberfläche identifiziert wird. Sammeln Sie dann den anderen Plexus choroideus lateralis.

Führen Sie dann die beiden Enden der Pinzette zwischen Kleinhirn und Mittelhirn ein und lösen Sie das Kleinhirn von den Pons und der Medulla, um den vierten Ventrikel freizulegen. Identifizieren Sie dann den vierten Plexus choroideus als eine lange, kugelförmige Struktur mit einem körnigen Oberflächenaspekt, der den vierten Ventrikel vom lateralen rechten Ende bis zum linken Ende zwischen dem Kleinhirn und der Medulla auskleidet. Sammeln Sie mit einer feinen Pinzette den vierten Plexus choroideus.

Nachdem Sie alle gesammelten Aderhautplexus mit Kollagenase IV inkubiert haben, pipettieren Sie vorsichtig etwa 10 Mal auf und ab, um die Dissoziation abzuschließen. Füllen Sie dann das Röhrchen auf 1,5 Milliliter mit MACS-Puffer, um die Kollagenase-IV-Aktivität zu stoppen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern MACS-Puffer waschen. Nach Zugabe der entsprechenden Kompensationskügelchen und Antikörperlösungen inkubieren Sie die Proben 30 bis 45 Minuten lang auf Eis, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen. Füllen Sie dann die Röhrchen mit 1,5 Millilitern MACS-Puffer.