Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

Beginnen Sie mit einem neugeborenen Mausgehirn und übertragen Sie es in ein Röhrchen, das eine proteolytische Enzymlösung enthält.

Die Enzyme bauen die extrazelluläre Matrix des Gewebes ab und initiieren die Zelldissoziation.

Waschen Sie das verdaute Gewebe wiederholt mit einem Wachstumsmedium, um die Enzyme zu entfernen.

Bewege das Gewebe mit einer Pipette mit größerem Durchmesser wiederholt durch die Pipette, um es in kleinere Fragmente zu zerlegen.

Fahren Sie dann mit einer Pipette mit kleinerem Durchmesser fort, die Fragmente zu dissoziieren, wodurch eine Zellsuspension entsteht.

Filtrieren Sie diese Suspension, um Zellklumpen zu entfernen, und erhalten Sie eine Einzelzellsuspension, die primäre Neuronen und eine gemischte Population von Gliazellen, einschließlich Mikroglia und Astrozyten, enthält.

Die Zellen werden in einen Kulturkolben mit einem Wachstumsmedium gesät und inkubiert, um ihre Adhärenz zu fördern.

Im Laufe der Zeit führt das Fehlen von Neuronenwachstumsfaktoren in den Medien zum Absterben von Neuronen.

Ersetzen Sie die verbrauchten Medien durch neue Medien. Gliazellen nutzen die Nährstoffe und vermehren sich, wodurch eine gemischte Gliakultur aus Astrozyten und Mikroglia entsteht.

Übertragen Sie das Gehirn in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 2 Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA und inkubieren Sie es 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Waschen Sie das Gehirn mit frischem Wachstumsmedium, indem Sie das Medium hinzufügen und entfernen. Nach Abschluss der Waschungen fügen Sie 2 Milliliter Wachstumsmedium pro Gehirn hinzu und homogenisieren Sie das Gehirn, indem Sie es verreiben.

Wenn das Hirngewebe nicht kleiner wird, wechseln Sie zu einer Pipette mit einer kleineren Öffnung. Am Ende der Titration, wenn die Suspension klar und ohne sichtbare Stücke ist, passieren Sie die Suspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um eine Einzelzellkultur zu erzeugen.

Pipettieren Sie dann 8 bis 9 Millimeter Wachstumsmedium in T75-Flaschen, zwei Flaschen pro Gehirn, und fügen Sie jedem Kolben 1 Milliliter Gehirnhomogenat hinzu. Züchten Sie die Zellen bis zur Isolierung am 16. Tag.