Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen in Mikroglia-ähnliche Zellen

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Neurowissenschaften

0 Ansichten • 4:03 Min. • July 8th, 2025

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Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit geringer Adhärenz, die humaninduzierte pluripotente Stammzellen in einem Embryoidkörper oder EB-Medium enthält.

Zentrifuge, um die Zellen abzusetzen. Inkubieren, um die Zellproliferation und -aggregation zu fördern und Embryoidkörper zu bilden.

Die Regulatoren der Zelllinie fördern die Zelldifferenzierung in myeloische Vorläuferzellen.

Sammeln Sie diese EBs und übertragen Sie sie an den Rand einer extrazellulären Matrix oder einer EZM-beschichteten Platte.

Ersetzen Sie das Medium durch einen primitiven Makrophagen-Vorläufer oder ein PMP-Differenzierungsmedium und rühren Sie es vorsichtig auf. Inkubieren, um die Bindung der EBs an das ECM zu erleichtern.

Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums und inkubieren Sie.

Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren treiben myeloische Vorläuferzellen an, sich zu primitiven Makrophagen-Vorläufern zu differenzieren, die sich von den EBs trennen und im Medium erscheinen.

Sammeln Sie diese PMPs und schleudern Sie die Zellen herunter. Resuspendieren Sie sie in einem Mikroglia-Differenzierungsmedium.

Aussäen Sie diese Zellen in einer lamininbeschichteten Multi-Well-Platte und inkubieren Sie.

PMPs nutzen die Differenzierungsfaktoren und Nährstoffe und differenzieren sich zu Mikroglia-ähnlichen Zellen, einer Art Immunzellen des Gehirns.

Geben Sie zum Plattieren von Zellen 100 Mikroliter der verdünnten Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und geringer Adhärenz. Zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 125 mal g und inkubieren Sie sie vier Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie an Tag 2 mit einer Mehrkanalpipette das alte halbe EB-Medium durch ein frisches Medium. Um primitive Makrophagen-Vorläufer oder PMPs zu erzeugen, beschichten Sie die Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 1 Milliliter eiskalter Matrigel-Beschichtungslösung. Inkubieren Sie die Platte dann bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für zwei Stunden oder über Nacht.

Am 4. Tag der EB-Differenzierung werden die EBs mit einer 1-Milliliter-Pipettenspitze in die Matrigel-beschichteten Vertiefungen überführt. Pipettieren Sie auf und ab, um die EBs aus der Vertiefung zu entfernen. Halten Sie dann die Platte gekippt, damit sich die EBs am Rand der Vertiefung absetzen können.

Sobald sich alle EBs abgesetzt haben, pipettieren Sie vorsichtig und ersetzen Sie das alte Medium, während Sie die EBs am Rand der Vertiefung mit 3 Millilitern frisch zubereitetem PMP-Komplettmedium halten. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Wells, indem Sie die Platten manuell von einer Seite zur anderen und von hinten nach vorne mischen. Inkubieren Sie die Platte dann sieben Tage lang, damit sich die EBs am Boden der Vertiefung anheften können.

Untersuchen Sie die EBs nach sieben Tagen unter einem Lichtfeldmikroskop mit 4-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie am Boden der Vertiefungen befestigt sind. Führen Sie einen halben Mediumwechsel durch und ersetzen Sie am 21. Tag das komplette Medium durch 3 Milliliter PMP-Komplettmedium.

Suchen Sie an Tag 28 im Überstand nach runden Zellen, die als PMPs bezeichnet werden. Sammeln Sie dann das Medium, das die PMPs enthält, mit einer 10-Milliliter-Pipette und einer automatischen Pipette, ohne die EBs zu stören.

Übertragen Sie die PMPs im Medium in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die gesammelten PMPs werden vier Minuten lang bei 200 g Proben zentrifugiert und der Überstand aspiriert, bevor sie in 1 bis 2 Millilitern Mikroglia-ähnlichen Zellen oder IMG-Basalmedium resuspendiert werden.

Zählen Sie dann die Zellen auf dem Hämozytometer, wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie den Rest der Zellen und verdünnen Sie die PMPs auf die gewünschte Konzentration. Anschließend werden die Zellen mit einer Dichte von 10bis 5 Zellen pro Quadratzentimeter auf mit Zellkulturen behandelten Platten unter Verwendung eines frisch zubereiteten IMG-Komplettmediums plattiert.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026