Isolierung von Zellpopulationen aus Hirngewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Übertragen Sie ein Stück frisch gefrorenes menschliches Hirngewebe in eine geeignete Mühle, die Kältelysepuffer enthält.

Bewegen Sie den Stößel auf und ab, um das Gewebe mechanisch zu brechen und die Zellen freizusetzen.

Die Detergensmoleküle im Lysepuffer brechen die Zellmembran auf und geben die Zellkerne frei.

Übertragen Sie den Inhalt in ein geeignetes Zentrifugenröhrchen und geben Sie kalten Saccharosepuffer auf den Boden des Röhrchens, wodurch ein Dichtegradient entsteht.

Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit, um die Kerne am Boden des Röhrchens zu trennen.

Den Überstand verwerfen und die Zellkerne in einer gepufferten Kochsalzlösung resuspendieren.

Fügen Sie den Zellkernen zielspezifische Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu und inkubieren Sie, damit der Antikörper an sein Kernprotein binden kann.

Fügen Sie Kernfärbefarbstoff hinzu, um die intakte DNA sichtbar zu machen.

Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellkernsortierung durch, um die Zellkerne verschiedener Zellpopulationen basierend auf unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen zu sortieren.

Beginnen Sie mit der Präparierung von etwa 200 bis 400 Milligramm Gewebe aus einer frischen, gefrorenen Gewebeprobe des erwachsenen Erwachsenen in der Hirnrinde. Legen Sie das Gewebe in einen 7-Milliliter-Glasgewebe-Douncer, der 4 Milliliter eiskalten Lysepuffer enthält, auf Eis und mahlen Sie das Gewebe etwa 50 Mal.

Übertragen Sie das Homogenat in ein 12-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Geben Sie mit einer 5-Milliliter-Pipette 6,5 Milliliter eiskalten Saccharosepuffer auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens, ohne die Grenzfläche zwischen der Saccharose und dem Gewebehomogenat zu stören.

Um die Kerne zu sammeln, ultrazentrifugieren Sie das Lysat eine Stunde lang bei 101.814 g und saugen Sie den Überstand und die Ablagerungen vorsichtig ab, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie PBS in das Ultrazentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Kernpellet.

Für die fluoreszenzaktivierte Sortierung der isolierten Zellkerne geben Sie etwa 20 Mikroliter der resuspendierten Probe zu einer Antikörperlösung, die AlexaFlour555-konjugierten Maus-Anti-NeuN-Antikörper enthält. Geben Sie etwa 20 Mikroliter der resuspendierten Probe in eine Antikörperlösung, die APC-konjugierten Maus-Anti-PAX6-Antikörper enthält. Nach einer einstündigen Inkubation bei 4 Grad Celsius und lichtgeschütztem Schütteln geben Sie DAPI im Verhältnis 1 zu 1.000 zu allen Proben und Kontrollen.