Gewinnung verschiedener neuronaler Zellpopulationen aus einem Hippocampus einer Ratte

Nehmen Sie perfundierte Hippocampus-Fragmente von Ratten.

Inkubieren Sie mit Papain, um die extrazelluläre Matrix des Gewebes zu verdauen und Zellen, einschließlich Neuronen, Astrozyten und Mikroglia, zu lockern.

DNase zugeben und mischen.

Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch mit Pipetten mit zunehmend abnehmendem Durchmesser, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Inkubieren, damit die DNase kontaminierende DNA abbauen kann.

Führen Sie die Suspension durch ein Sieb und entfernen Sie Ablagerungen.

Fügen Sie Puffer mit zweiwertigen Ionen hinzu, um die enzymatische Aktivität zu stoppen.

Zentrifugieren und den enzymreichen Überstand entfernen.

Fügen Sie nun Puffer und Anti-Myelin-Magnetkügelchen hinzu. Inkubieren Sie für die Kügelchen, um die Myelintrümmer zu binden.

Nach der Inkubation zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Das Gemisch wird wieder in einen Puffer suspendiert und auf eine magnetische Trennsäule geladen, die ferromagnetische Kugeln enthält, die im Magnetfeld des Magnetsortierers platziert sind.

Das Magnetfeld hält magnetische beadgebundene Myelintrümmer in der Säule zurück, während myelinfreie Zellen hindurchgehen.

Waschen Sie die Säule mit Puffer und sammeln Sie den Durchfluss mit Neuronen, Astrozyten und Mikroglia.

Beginnen Sie die neuronale Dissoziation, indem Sie jede Probe aus adultem Gehirngewebe mit sterilen Rasierklingen auf dem Deckel einer Sechs-Well-Kulturplatte in kleine 30- bis 400-Milligramm-Stücke schneiden. Tauchen Sie dann das Gewebe in 1 Milliliter calcium- und magnesiumfreies HBSS und überführen Sie die Proben mit einer Pipette in sterile 2-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Wenn alle Gewebe entnommen wurden, zentrifugieren Sie die Proben, aspirieren Sie die Überstände und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad, wobei Sie das Röhrchen mehrmals alle fünf Minuten umdrehen, um die abgesetzten Gewebestücke wieder zu suspendieren.

Am Ende der Inkubation geben Sie 30 Mikroliter frisch vorbereitetes Enzym-Mischröhrchen in jede Probe und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um. Dissoziieren Sie dann mit einer Pasteur-Pipette mit der Bezeichnung 1 jede Probe mit 30 Auf- und Ab-Verreibungen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Inkubieren Sie die Proben für weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Inversion alle fünf Minuten, gefolgt von der Dissoziation der Proben mit der Pasteur-Pipette Nummer 2, wie gerade gezeigt.

Wechseln Sie dann zu Pipette Nummer 3. Wiederholen Sie die Dissoziation und inkubieren Sie die Proben weitere 10 Minuten im Wasserbad, wobei alle fünf Minuten eine Umkehrung durchgeführt wird. Am Ende der Inkubation filtrieren Sie die Einzelzellsuspensionen durch 80-Mikron-Zellsiebe in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen und waschen Sie jedes Sieb mit 10 Millilitern kalzium- und magnesiumfreiem HBSS, um die enzymatischen Reaktionen zu stoppen. Wenn die letzte Probe filtriert wurde, drehen Sie die Röhrchen herunter und saugen Sie die Überstände an.

Um das Myelin aus den Zellsuspensionen zu erschöpfen, resuspendieren Sie die Pellets gründlich in 400 Mikrolitern Myelinentfernungspuffer und geben Sie die entsprechende Menge an Myelinentfernungsperlen in jedes Röhrchen. Pipettieren Sie die Lösungen auf und ab, bis die Zellen und Kügelchen gründlich vermischt sind. Inkubieren Sie die Probe dann 15 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie jede Probe nach der Inkubation in 5 Millilitern Myelinentfernungspuffer

Während sich die Zellen drehen, legen Sie eine Säule für jede Probe in das Magnetfeld eines Magnetsortierers und platzieren Sie einen sauberen 80-Mikron-Filter auf jeder Säule. Spülen Sie jeden Filter und jede Säule dreimal mit 1 Milliliter Myelin-Entfernungspuffer und sammeln Sie den gesamten Durchfluss in einem Abfallbehälter.

Legen Sie nach der letzten Spülung 5-Milliliter-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden direkt unter jede Säule, um das Eluat aufzufangen. Aspirieren Sie dann den Überstand aus den Proben und resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Myelinentfernungspuffer

Tragen Sie die Zellsuspensionen sofort auf die Säulen auf und sammeln Sie die Zellen in den darunter liegenden Röhrchen. Spülen Sie dann jeden Filter und jede Säule 4 Mal mit 1 Milliliter Myelinentfernungspuffer pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche schleudern Sie die Zellen herunter und aspirieren die Überstände.