Gewinnung von Kleinhirnschnitten aus einem embryonalen Kükengehirn

Entnehmen Sie ein befruchtetes Hühnerei in einem geeigneten Entwicklungsstadium.

Schneiden Sie die Schale ab, um an den Embryo zu gelangen.

Lokalisieren und präparieren Sie den Kopf und geben Sie ihn dann in eine Petrischale, die gekühlten Phosphatpuffer enthält.

Entferne die Augen und den Kiefer.

Trenne die Haut von der Oberfläche des Schädels.

Als nächstes schneidest und entfernst du die Schädelknochen.

Befreien Sie das umgebende Bindegewebe, um das Gehirn freizulegen.

Trennen Sie das Vorderhirn.

Löse dann das Kleinhirn vom Hinterhirn und dem Blutgefäß.

Das Kleinhirn in einen gekühlten Salzpuffer geben.

Das embryonale Kleinhirn enthält eine Schicht aus sich schnell teilenden neuronalen Vorläuferzellen, was es für Neurogenese-Studien wertvoll macht.

Lege das Kleinhirn auf die Plattform eines Gewebezerkleinerers.

Überschüssigen Puffer entfernen und das Kleinhirn in Scheiben schneiden.

Geben Sie gekühlten Salzpuffer auf die Scheiben.

Übertragen Sie die Kleinhirnscheiben in eine Petrischale mit gekühltem Salzpuffer.

Trennen Sie unter einem Mikroskop einzelne Scheiben für die weitere Analyse.

Legen Sie zunächst befruchtete braune Hühnereier in einen 38 Grad Celsius heißen Ei-Inkubator, bis sie den 14. Embryonaltag erreichen. Schneiden Sie am 14. Tag des Embryos eine Öffnung in das Ei, um den Embryo freizulegen, und enthaupten Sie den Hühnerembryo in Ovo. Legen Sie den Kopf in eine Petrischale, die eiskaltes PBS enthält.

Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine Standardzange, um hinter jedem Auge einen Schnitt durch das gesamte Gewebe zu machen und die Augen und den Oberkiefer zu entfernen. Machen Sie dann einen zweiten Schnitt durch den Rachen, um den Unterkiefer zu entfernen. Verwenden Sie als Nächstes eine Standardzange, um die Haut von der Oberfläche des Schädels zu entfernen, indem Sie sie abziehen. Entfernen Sie dann die Stirn- und Scheitelknochen und legen Sie das Gehirn frei.

Aus ventraler Sicht ist der Rachenknorpel und das Hilfsmesenchym zu entfernen. Platzieren Sie dann das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben und entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym dorsal zum Hinterhirn, wobei Sie darauf achten, die Pia nicht zu beschädigen. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt durch das gesamte Gewebe zwischen dem Mittelhirn und dem Hinterhirn, um das Hinterhirn, einschließlich des Kleinhirns, zu lösen. Machen Sie Schnitte durch das gesamte Gewebe sowohl an den lateralen Übergängen des Kleinhirns als auch an der Flügelplatte des Hinterhirns. Entfernen Sie das gesamte Kleinhirn und achten Sie darauf, dass die Integrität der Pia während der gesamten Dissektion erhalten bleibt.

Entfernen Sie zum Schluss den sich bildenden Plexus choroideus und verschieben Sie das präparierte Kleinhirn in eiskaltes HBSS. Übertragen Sie das gesamte Kleinhirn mit einem Spatel oder einer 3-Milliliter-Pasteurpipette auf die sterile Plattform eines Gewebezerkleinerers, wobei die Spitze weggeschnitten wird, um die Öffnung zu erweitern. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette.

Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit des Gewebezerkleinerers auf 50 % des Maximalwerts ein. Schneiden Sie dann das Kleinhirn in der gewünschten Ausrichtung bei einer Dicke von 300 Mikrometern ab. Mit einer 3-Milliliter-Pasteur-Pipette das in Scheiben geschnittene Kleinhirn mit kaltem HBSS bedecken.

Übertragen Sie dann das HBSS und die Scheiben mit der 3-Milliliter-Pasteur-Pipette mit der abgeschnittenen Spitze in eine 60-Millimeter-Petrischale mit 20 Millilitern eiskaltem HBSS. Stellen Sie die Petrischale unter ein Präpariermikroskop, das mit einer faseroptischen Lichtquelle beleuchtet wird. Verwenden Sie dann eine Uhrmacherzange, um einzelne Scheiben des Gehirngewebes zu trennen.