Etablierung primärer gemischter Gliazellkulturen aus dem Rückenmark einer Maus

Entnehmen Sie das Rückenmark von Mäusen und schneiden Sie sie in Fragmente.

Übertragen Sie die Fragmente in ein Röhrchen, das ein proteolytisches Enzym und DNase enthält. Vortexen und inkubieren.

Das Enzym verdaut die extrazelluläre Matrix des Gewebes, während DNase kontaminierende freie DNA abbaut.

Erneut vortexen und wiederholt pipettieren, um die Dissoziation des Gewebes abzuschließen und eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Lösung, die DNase und einen Proteaseinhibitor enthält, und wirbeln Sie sie auf. Der Inhibitor neutralisiert das Enzym.

Schichten Sie frische Inhibitorlösung auf die Oberseite, zentrifugieren Sie sie und entfernen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in Dichtegradientenmedien, Vortex und zentrifugieren Sie dann.

Die Zellen siedeln sich unten an, während die Myelintrümmer oben verbleiben.

Entsorgen Sie den Rest. Wiederholt mit Puffer waschen, zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in Wachstumsmedien.

Plattieren Sie die Zellen. Die unbeschichtete Oberfläche erleichtert die Anheftung von Gliazellen.

Entfernen Sie das verbrauchte Medium und fügen Sie frisches Medium hinzu, um die Proliferation der Gliazellen zu induzieren und eine gemischte Gliakultur zu etablieren.

Übertragen Sie in einer Gewebekulturhaube vier Rückenmark der Maus in eine Petrischale mit HBSS. Schneide jedes Rückenmark mit einer sterilen Schere und Pinzette in kleine Stücke. Übertragen Sie dann die Stücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das die Papain-DNase-Enzymmischung enthält. Vermeiden Sie die Übertragung von HBSS auf das Enzymgemisch, da dies zu einer verminderten Leistung des Enzyms führen kann.

Es ist entscheidend, dass Gewebestücke gut verdaut werden, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Eine Überverdauung führt jedoch zu weniger lebensfähigen Zellen. Jedes Labor muss Pilotversuche durchführen, um die genaue Verdauungszeit zu bestimmen, je nachdem, was für seine Zellen am besten funktioniert.

Drehen Sie dann das Röhrchen vorsichtig vor und inkubieren Sie es dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit orbitalem Schütteln mit 150 Umdrehungen pro Minute. Nach der Inkubation wirbeln Sie das Röhrchen vor und zerkleinern Sie das Gewebe dann mit einer 5-Milliliter-Pipette kräftig, um die weitere Dissoziation zu fördern. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-mal g.

Während der Zentrifugation 300 Mikroliter rekonstituierte Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung zu 2,7 Millilitern EBSS in einem sterilen Röhrchen geben und gut mischen. Fügen Sie dann 150 Mikroliter DNase-Lösung hinzu. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Zellpellet in dem frisch zubereiteten Albumin-Ovomucoid-Inhibitor und der DNase-Lösung resuspendiert. Vortexen Sie gut, um das Zellpellet zu brechen.

Geben Sie dann 3 Milliliter rekonstituierte Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung ohne DNase in die Zellsuspension. Die Zellen werden bei 70 mal g für 6 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand, der Membranfragmente enthält, und bewahren Sie das Pellet auf.

Um Myelin aus den dissoziierten Rückenmarkszellen zu entfernen, geben Sie zunächst 8 Milliliter Raumtemperatur mit 20 % Dichtegradientenmedium in das Röhrchen, das das Zellpellet enthält, und wirbeln Sie vorsichtig vortexen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur, ohne zu brechen. Nach dem Zentrifugieren wird die oberste Schmutzschicht, die hauptsächlich Myelin enthält, und der Überstand, der das Pellet verlässt, vorsichtig abgesaugt.

Um den verbleibenden Dichtegradienten zu entfernen, waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet mit 8 Millilitern cDMEM, verdünnt mit HBSS, resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen wie zuvor mit verdünntem cDMEM.

Nach dem Entfernen des Überstands kann das Pellet bis zur Aussaat der Zellen auf Eis gelagert werden. Sobald die Zellen für die Beschichtung bereit sind, resuspendieren Sie sie in 14 Millilitern cDMEM, ergänzt mit 2-Mercaptoethanol, und geben Sie 1 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung in einer 12-Well-Platte.

Platten Sie zusätzliche Vertiefungen, mit denen die durchschnittliche Zellzahl pro Vertiefung und der Mikrogliagehalt der Kultur bestimmt werden können. Sobald die Zellen plattiert sind, inkubieren Sie die Zellen bei 35,9 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium an Tag 1, d. h. am Tag nach dem Plattieren.

Einige Zellen sind an der Kulturplatte befestigt, aber sie sind immer noch meist rund. Es gibt auch viele schwimmende Zellen und erhebliche Trümmer. Wiederholen Sie den Medienwechsel drei bis vier Tage danach.