Differenzierung immortalisierter multipotenter otischer Vorläuferzellen in spiralförmige Ganglienneuronen und Bewertung der Differenzierung

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit sterilen Deckgläsern, die mit einem Zellkultursubstrat beschichtet sind.

Einführung von immortalisierten multipotenten otischen Vorläuferzellen (iMOPs) in einem neuronalen Differenzierungsmedium.

iMOPs sind Vorläufer verschiedener Innenohrzellen, einschließlich Spiralganglien-Neuronen (SGNs), die auditive Informationen an das Gehirn übertragen.

Inkubieren Sie und lassen Sie die Zellen am Substrat haften. Das Medium bewirkt eine Differenzierung der iMOPs in SGNs.

Fügen Sie ein Fixiermittel hinzu, um die Proteinvernetzung zu induzieren, die Zellmorphologie zu erhalten, und eine Detergenslösung, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Führen Sie ein blockierendes Reagenz ein, um eine unspezifische Markierung zu verhindern.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu, die spezifisch für neuronale Differenzierungsmarker sind, und inkubieren Sie, damit die Antikörper die SGNs markieren können.

Waschen Sie, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und montieren Sie die Deckgläser mit einem Eindeckmedium, das einen fluoreszierenden Kernfleck enthält.

Detektieren Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die Antikörpersignale, um die Differenzierung von iMOPs in SGNs zu bestätigen.

Reinigen Sie zunächst runde Glasdeckgläser, indem Sie sie in eine sterile 100-Millimeter-Platte legen und in 70 % Ethanol tauchen. Rühren Sie die Deckgläser vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie abgedeckt sind, und lassen Sie die Schüssel 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie anschließend die Deckgläser dreimal in sterilem 1x PBS und dann einmal mit sterilem Wasser aus.

Lassen Sie dann die Deckgläser trocknen, indem Sie sie 15 Minuten lang in einer Gewebekulturhaube UV-Licht aussetzen. Legen Sie zur sofortigen Verwendung ein steriles Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Deckgläser flach aufliegen. Beschichten Sie dann die Deckgläser, indem Sie 0,25 Milliliter 1x PBS mit 10 Mikrogramm Poly-D-Lysin pro Milliliter in jede Vertiefung geben.

Nachdem die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde, entfernen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit sterilem 1x PBS. Sobald die Flüssigkeit aus der letzten Wäsche abgesaugt wurde, geben Sie 0,25 Milliliter 1x PBS mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in jede der 24 Vertiefungen. Nachdem Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, aspirieren Sie die Lamininlösung. Waschen Sie dann jede Vertiefung dreimal mit 1 Milliliter 1x PBS, aber lassen Sie das PBS von der letzten Wäsche in den Vertiefungen, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden.

Um mit der neuronalen Differenzierung zu beginnen, zählen Sie die Zellen aus dissoziierten Otosphären, wie zuvor beschrieben, und resuspendieren Sie sie dann in einem vorgewärmten neuronalen Differenzierungsmedium. Fahren Sie fort, indem Sie zwischen 1 und 1,5 x 10⁵ iMOP-Zellen in jede Vertiefung der Platte mit den beschichteten Deckgläsern aussäen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und ersetzen Sie das neuronale Differenzierungsmedium jeden zweiten Tag.

Nach sieben Tagen aspirieren Sie das Medium und fixieren die Zellen, die an den Deckgläsern befestigt werden sollten, indem Sie 4 % Formaldehyd in jede Vertiefung geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Entfernen Sie dann das Formaldehyd und waschen Sie die Zellen einmal in 1x PBS mit 0,1% Triton X-100. Entfernen Sie anschließend den Waschpuffer und geben Sie einen Blockierungspuffer bestehend aus 1x PBS mit 10 % normalem Ziegenserum und 0,1 % Triton X-100 in jede Vertiefung.

Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die Flüssigkeit und ersetzen Sie sie durch einen Blockierungspuffer, der die entsprechende Verdünnung von Cdkn1b- oder Tubb3-Antikörpern enthält. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS mit 1% Triton X-100 und fahren Sie dann mit der Immunfärbung wie zuvor beschrieben fort. Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, führen Sie eine letzte Wäsche durch, indem Sie 1x PBS in die Vertiefungen geben.

Um sie für die Analyse vorzubereiten, entfernen Sie die Deckgläser, an denen die Fleckenzellen befestigt sind, von der 24-Well-Platte und legen Sie sie auf ein Eindeckmedium auf einem Objektträger. Nachdem Sie das Eindeckmedium über Nacht bei 4 Grad Celsius trocknen ließen, nehmen Sie Epifluoreszenzbilder wie zuvor beschrieben auf.