JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:29 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine transgene schwangere Maus, isolieren Sie chirurgisch die Gebärmutter mit Embryonen und waschen Sie sie, um Blutreste zu entfernen.
Entnehmen Sie die Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Motoneuronen und übertragen Sie sie auf den Deckel einer Multiwell-Platte.
Fügen Sie geschmolzene Agarose hinzu und kühlen Sie den Deckel, um die Gelbildung zu induzieren und die Embryonen einzubetten.
Richten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop die okulomotorischen Kerne und die Augen in einer Linie aus und trimmen Sie die Agarose parallel zur Linie.
Fixieren Sie einen Embryo auf einem Probentisch und legen Sie ihn in eine Vibratomkammer, die mit einem Kaltschneidepuffer gefüllt ist.
Erzeugen Sie mit dem Vibratom Schnitte, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthalten. Die Kerne bilden die okulomotorischen Nerven, die die Augenbewegung steuern.
Übertragen Sie die Scheiben auf Kultureinsätze in einer Multi-Well-Platte, die ein Kulturmedium enthält, und inkubieren Sie.
Nehmen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop in regelmäßigen Abständen Bilder auf, um die fluoreszenzmarkierten okulomotorischen Neuronen zu beobachten, die Axone bis zu den Augen ausdehnen.
Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, bestätigen Sie zunächst die Schwangerschaft durch Ultraschall am embryonalen Tag 10,5 aus einer zeitgesteuerten Paarung. Entnehmen Sie die Embryonen, besprühen Sie den Bauch der trächtigen Maus mit 70% Ethanol und öffnen Sie mit einer Schere die Bauchhöhle, um die Gebärmutter zu extrahieren. Waschen Sie die Gebärmutter in einer Petrischale mit eiskaltem HBSS, bevor Sie das Organ in eine zweite Petrischale mit frischem eiskaltem HBSS legen.
Entnehmen Sie unter einem Präpariermikroskop die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und ihre einzelnen Fruchtblasen, indem Sie jeden Embryo während der Entnahme auf die Unterseite des Deckels einer 12-Well-Platte auf Eis legen. Verwenden Sie Filterpapier, um alle Flüssigkeiten zu entfernen, die jeden Embryo umgeben, ohne die Embryonen selbst zu berühren, und tauchen Sie die Embryonen in flüssige 4% niedrigschmelzende Agarose.
Lege den Tellerdeckel auf Eis, um die Agarose fest zu machen. Wenn die Agarose ausgehärtet ist, drehen Sie die Embryonen um und bedecken Sie die andere Seite jeder Probe mit zusätzlicher Agarose. Wenn das zweite Volumen der Agarose erstarrt ist, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Agarose um jeden Embryo herum zu trimmen, so dass jeder Embryo richtig auf dem Vibratomstadium ausgerichtet ist.
Die okulomotorischen Kerne und die frühen Axonauswüchse sollten fluoreszierend sein. Richten Sie jeden Embryo so aus, dass der Kern, die ausgehenden Axone und das Auge eine Linie bilden, und schneiden Sie die Agarose mit einer Rasierklinge parallel zu dieser Linie ab. Füllen Sie als Nächstes eine Vibratomkammer mit eiskaltem Scheibenpuffer und kleben Sie den ersten Embryo mit Sekundenkleber auf das Vibratomstadium, so dass die Klinge parallel zum okulomotorischen Kern und den Augen ist.
Wenn der Sekundenkleber trocken ist, tauchen Sie das Vibratomstadium so ein, dass der Embryo von der Klinge abgewandt ist, und verwenden Sie eine neue Vibrato-Klinge, um 400 bis 450 Mikrometer große Scheiben zu erhalten. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um jede Scheibe nach der Aufnahme in einen Cold-Slicing-Puffer zu überführen, und wählen Sie mit dem Fluoreszenzmikroskop die Scheibe aus, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthält.
Übertragen Sie die Scheibe mit einer sterilen Transferpipette auf eine Zellkultur, setzen Sie sie in eine 6-Well-Platte mit 1,5 Millilitern Nährmedium pro Well ein und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Entfernen Sie die restliche Agarose aus dem unteren Stadium und kleben Sie den nächsten Embryo mit Sekundenkleber auf den Tisch, indem Sie weiterhin Scheiben sammeln, bis alle Embryonen geschnitten und plattiert sind, und alle 30 Minuten ein Bild der Scheiben durch Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie für bis zu 72 Stunden machen.