Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dorsolateralen Telencephalonen von Mausembryonen

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Neurowissenschaften

0 Ansichten • 4:47 Min. • July 8th, 2025

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Nehmen Sie einen Mausembryo in einen Puffer und trennen Sie den Schädel, um das Gehirn zu isolieren.

Entfernen Sie die Hirnhäute, die membranöse Schicht, die das Gehirn bedeckt.

Präpariere das Gehirn, um die Hemisphären zu trennen.

Isolieren Sie die dorsolateralen Telencephalonen von den Hemisphären und übertragen Sie sie in eine Röhre.

Die dorsolateralen Telencephalons sind reich an Neuronen und neuralen Vorläuferzellen.

Zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Füge eine Enzymlösung hinzu. Die Enzyme brechen die Gewebematrix auf und lockern die Zellen auf.

Führen Sie ein Proliferationsmedium ein, das Serum enthält. Die Serumproteine hemmen die Enzymaktivität.

Verwenden Sie eine Pipette, um das Gewebe mechanisch zu dissoziieren und eine Zellsuspension zu bilden.

Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand, der inaktivierte Enzyme und Gewebereste enthält.

Resuspendieren Sie die Zellen im Proliferationsmedium.

Übertragen Sie die Zellen auf eine mit Zellkultursubstrat beschichtete Mikroplatte.

Inkubieren, damit die Zellen am Substrat haften. Das Medium erleichtert die Proliferation von Vorläuferzellen.

Beginnen Sie mit der Entnahme der Gehirne von 5 bis 10 E14-Embryonen in einer Petrischale mit kaltem Präpariermedium. Ziehe mit einer Pinzette vorsichtig die Haut und den Schädel heraus und isoliere das Gehirn. Verwenden Sie bei der Arbeit unter dem Stereomikroskop eine Präparierzange, um die Hirnhäute zu entfernen. Teile dann das Telencephalon in der Mitte, um die Hemisphären zu trennen.

Um das dorsolaterale Telencephalon zu isolieren, schneiden Sie entlang der dorsomedialen Kurve und der pallial-subpallialen Grenze. Übertragen Sie das dorsolaterale Telencephalon in ein 2-Milliliter-Röhrchen mit Präpariermedium auf Eis, bis alle Gehirne präpariert sind. Nach der Mikrodissektion des dorsolateralen Telencephalons legen Sie das Gewebe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen mit dem gesammelten Gewebe und dem Kaltdissektionsmedium 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius und 340 mal g, um das Gewebe auszufällen. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand mit der Pipette und fügen Sie 1 Milliliter 37 Grad Celsius 0,05 % Trypsin-EDTA für den chemischen Aufschluss hinzu. 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation fügen Sie 2 Milliliter Proliferationsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu hemmen. Polieren Sie anschließend die Spitze einer Pasteurpipette aus Glas einige Sekunden lang über einem Gasbrenner oder Bunsenbrenner, um die Öffnung etwas zu verkleinern. Aspirieren Sie FCS, um die Spitze der Pipette zu beschichten. Dissoziieren Sie dann die Zellen mechanisch mit der feuerpolierten und FCS-beschichteten Pasteur-Pipette, indem Sie auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, dass keine Blasen entstehen.

Die dissoziierten Zellen werden 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius und 340 mal g zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Pipette entfernt. Fügen Sie dann 1 Milliliter Proliferationsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Pipette. Entfernen Sie das PBS von der mit Poly-D-Lysin vorbehandelten Platte. Zeichnen Sie dann ein Zeichen auf die Unterseite der Platte, das als Referenz zur Bestimmung des Nullpunkts verwendet werden kann.

Nachdem Sie die Zellen zum zweiten Mal in Proliferationsmedium resuspendiert haben, bereiten Sie eine 1:1-Verdünnung der Zellsuspension mit einer 0,4%igen Trypanblaulösung vor. In die Objektträger der Zählkammer laden und die Anzahl der ungefärbten lebensfähigen Zellen zählen. Nicht lebensfähige Zellen sind blau. Verdünnen Sie die Zellen in Proliferationsmedium, um 10bis 6 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026