Infektion von primären Mittelhirnneuronen der Maus mit gentechnisch veränderten Adeno-assoziierten Viren

Beginnen Sie mit einer embryonalen Zellkultur aus dem Mittelhirn der Maus auf einem Deckglas.

Behandlung mit gentechnisch veränderten Adeno-assoziierten Viren, die für einen fluoreszierenden Kalziumindikatorkomplex unter einem neuronenspezifischen Promotor kodieren.

Inkubieren für die Anheftung und Internalisierung von Viren.

Entfernen Sie das Medium, um ungebundene Viren zu eliminieren, fügen Sie dann ein Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie.

Internisierte Viren setzen ihr Genom im Zellkern frei, wo der neuronenspezifische Promotor die Produktion von Kalziumindikatorkomplexen ausschließlich in primären Neuronen antreibt.

Zu diesen Komplexen gehören ein fluoreszierendes Protein, das mit einem Kalzium-bindenden Protein und einem M13-Peptid markiert ist.

Übertragen Sie das Deckglas in eine Schale mit einem Aufnahmepuffer, der reich an Kalziumionen ist, und legen Sie es dann in eine Aufnahmekammer für konfokale Live-Bildgebung.

Führen Sie einen Glutamat-Aufzeichnungspuffer ein, der bewirkt, dass Glutamat an Ionenkanäle bindet, was zum Eintritt von Kalziumionen führt.

Diese Ionen binden an den Komplex, was zu einer Konformationsänderung und Fluoreszenzemission führt.

In der Live-Bildgebung zeigen die hellen Neuronen die Virusinfektion an.

Beginnen Sie mit der Zubereitung von 1 Milliliter serumfreiem DMEM-Medium mit 1 Mikroliter hSyn-GCaMP6f AAV pro Schale. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jeder Schale und ersetzen Sie es durch 1 Milliliter des vorbereiteten DMEM mit hSyn-GCaMP6f. Stellen Sie das Geschirr für eine Stunde zurück in den 37 Grad heißen Inkubator.

Nach der Inkubation aspirieren Sie das Medium mit AAVs und ersetzen es durch 3 Milliliter Zellkulturmedium. Inkubieren Sie die Gerichte fünf bis sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius und wechseln Sie das Medium während dieser Zeit der Virusinfektion alle zwei bis drei Tage.

Bereiten Sie 1 Liter des HEPES-Aufzeichnungspuffers, 200 Milliliter 20 mikromolare Glutamat-Aufzeichnungspuffer und 200 Milliliter 10 mikromolare NBQX-Aufzeichnungspuffer gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor.

Füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Petrischale mit 3 Millilitern des Aufnahmepuffers. Nehmen Sie die Petrischale mit den infizierten Kulturen aus dem Inkubator. Fassen Sie dann vorsichtig den Rand eines Deckglases mit einer Pinzette mit feiner Spitze und übertragen Sie es in die Schale mit dem Aufnahmepuffer.

Legen Sie das restliche Deckglas in Medium zurück in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und transportieren Sie die Schale mit Aufnahmepuffer zum Konfokalmikroskop. Starten Sie die Imaging-Software. Starten Sie während der Initialisierung die Peristaltikpumpe und legen Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer. Kalibrieren Sie dann den Durchfluss auf 2 Milliliter pro Minute.

Übertragen Sie das infizierte Deckglas mit einer feinen Pinzette aus der Petrischale in das Aufnahmebad. Mit dem 10-fachen Wasserimmersionsobjektiv und Hellfeldlicht finden Sie die Fokusebene und suchen nach einer Region mit einer hohen Dichte an Neuronenzellkörpern. Wechseln Sie dann zum 40-fach-Objektiv und fokussieren Sie die Probe neu.

Wählen Sie AlexaFluor 488 im Farblistenfenster aus und wenden Sie es an. Um eine Überbelichtung und Photobleichung der Fluorophore zu vermeiden, beginnen Sie mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen.

Stellen Sie für den AlexaFluor 488-Kanal den HV auf 500, die Verstärkung auf 1x und den Offset auf 0 ein. Stellen Sie die Leistung für die Laserlinie 488 auf 5 % ein. Erhöhen Sie die Lochblende auf 300 Mikrometer und verwenden Sie die Scanoption "Focus x2", um die Emissionssignale optimal an die Untersättigung anzupassen. Die Einstellungen können dann für eine optimale Sichtbarkeit jedes Kanals angepasst werden.

Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie den Tisch, um eine Region mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Änderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz aufweisen, und fokussieren Sie auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung.

Verwenden Sie das Werkzeug "Rechteck beschneiden", um den Bildframe auf eine Größe zu beschneiden, die ein Frame-Intervall von knapp einer Sekunde erreichen kann. Legen Sie das Intervallfenster auf den Wert 1,0 und das Num-Fenster auf 600 fest.

Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option "Zeit". Verwenden Sie dann die Scanoption "XYt", um mit der Bildgebung zu beginnen. Beobachten Sie den Fortschrittsbalken der Bildgebung und verschieben Sie die Leitung vom HEPES-Aufzeichnungspuffer zum richtigen Zeitpunkt in den 20-Mikromol-Glutamat-Aufzeichnungspuffer.

Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche "Serie fertig" und speichern Sie den fertigen Film der T-Serie. Fahren Sie fort, das Glutamat für weitere 5 Minuten zu perfundieren, so dass die kultivierten Neuronen insgesamt 10 Minuten lang Glutamat ausgesetzt waren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Deckglas, das abgebildet werden soll.