Infektion von primären Mittelhirnneuronen der Maus mit gentechnisch veränderten Adeno-assoziierten Viren

Beginnen Sie mit einer embryonalen Zellkultur aus dem Mittelhirn der Maus auf einem Deckglas.

Behandlung mit gentechnisch veränderten Adeno-assoziierten Viren, die für einen fluoreszierenden Kalziumindikatorkomplex unter einem neuronenspezifischen Promotor kodieren.

Inkubieren für die Anheftung und Internalisierung von Viren.

Entfernen Sie das Medium, um ungebundene Viren zu eliminieren, fügen Sie dann ein Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie.

Internisierte Viren setzen ihr Genom im Zellkern frei, wo der neuronenspezifische Promotor die Produktion von Kalziumindikatorkomplexen ausschließlich in primären Neuronen antreibt.

Zu diesen Komplexen gehören ein fluoreszierendes Protein, das mit einem Kalzium-bindenden Protein und einem M13-Peptid markiert ist.

Übertragen Sie das Deckglas in eine Schale mit einem Aufnahmepuffer, der reich an Kalziumionen ist, und legen Sie es dann in eine Aufnahmekammer für konfokale Live-Bildgebung.

Führen Sie einen Glutamat-Aufzeichnungspuffer ein, der bewirkt, dass Glutamat an Ionenkanäle bindet, was zum Eintritt von Kalziumionen führt.

Diese Ionen binden an den Komplex, was zu einer Konformationsänderung und Fluoreszenzemission führt.

In der Live-Bildg