Vorbereitung von rhinalen Cortex-Hippocampus-Schnitten aus dem Gehirn eines Rattenwelpen

Nehmen Sie ein frisch geerntetes Gehirn eines Rattenwelpen mit der Rückenseite nach oben in eine Kulturplatte mit gekühltem Puffer.

Öffnen Sie die Gehirnhälften und entfernen Sie das Gewebe, das den Hippocampus bedeckt.

Schneiden Sie die Hemisphären so ein, dass sie die Hippocampi und die rheinische Rinde enthalten.

Legen Sie beide Hemisphären mit den Hippocampi nach oben und parallel auf ein Filterpapier.

Übertragen Sie diese Anordnung auf einen Gewebezerkleinerer, wobei die Klinge senkrecht zu den Halbkugeln steht.

Schneiden Sie die Halbkugeln auf die gewünschte Dicke, um Scheiben zu erhalten, und geben Sie sie auf eine Kulturplatte mit gekühltem Puffer.

Trennen Sie die Scheiben vorsichtig und zerlegen Sie sie, um strukturell intakte Regionen des Hippocampus und der rheinalen Rinde einzubeziehen.

Übertragen Sie die Scheiben auf membranöse Einsätze in einer Multiwell-Platte, die das Medium enthält.

Entfernen Sie den überschüssigen Puffer von den Scheiben und inkubieren Sie sie zur Gewebewiederherstellung.

Aktualisieren Sie die Medien. Die Scheiben können für die weitere Analyse verwendet werden.

Übertragen Sie das Gehirn mit der Rückenseite nach oben in eine 60-Millimeter-Platte, die 5 Milliliter kaltes GBSS enthält. Führen Sie eine feine Pinzette in das Kleinhirn ein und führen Sie den Spatel entlang der Mittellinie ein, um die Hemisphäre vorsichtig zu öffnen. Verwenden Sie eine kurze, gebogene Pinzette, um das überschüssige Gewebe, das den Hippocampus bedeckt, vorsichtig zu entfernen, ohne die Hippocampusstruktur zu berühren. Schneiden Sie dann unter jedem Hippocampus.

Übertragen Sie jeweils eine Hemisphäre mit der Hippocampus-Seite nach oben und parallel zueinander auf ein Blatt Filterpapier. Legen Sie das Filterpapier so senkrecht zur Klinge auf einen Gewebezerkleinerer, dass die Halbkugeln senkrecht zur Klinge stehen, und schneiden Sie die Halbkugeln in 350-Mikron-Scheiben. Übertragen Sie das geschnittene Gewebe in eine neue Petrischale, die 5 Milliliter kaltes GBSS enthält, und verwenden Sie Elektroden mit runden Spitzen, um die Scheiben vorsichtig zu trennen.

Bewahren Sie nur die Proben mit einer strukturell intakten Rhinalrinde und einem intakten Hippocampus auf und platzieren Sie mit einem Spatel und einer Elektrode mit runder Spitze bis zu vier intakte Scheiben auf einzelnen Einsätzen in der entsprechenden Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, die 1,1 Milliliter Kulturmedium pro Vertiefung enthält.

Verwenden Sie eine P20-Pipette, um überschüssiges Seziermedium um jede Scheibe herum zu entfernen. Stellen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Einsatz anzuheben. Saugen Sie das Medium aus der entsprechenden Vertiefung an und setzen Sie den Einsatz wieder ein. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um 1 Milliliter frisches Medium mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius in jede Vertiefung zu geben.