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Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:52 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Vertiefung, die neurale Vorläuferzellen oder NPC-Aggregate zur Unterscheidung von Medien-1 oder DM-1 enthält.
Diese NPCs sind Vorläufer der neuronalen Abstammung, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen oder hiPSCs unter Verwendung von DM-1 unter kontrollierten Bedingungen erzeugt wurden.
Übertragen Sie die NPC-Aggregate auf einen Membraneinsatz, der sich in einer Vertiefung mit DM-1 befindet, und entfernen Sie überschüssiges Medium.
Ändern Sie das Medium auf DM-2 und inkubieren Sie.
DM-2 liefert Nährstoffe und Differenzierungsfaktoren, die die Reifung von NPCs zu verschiedenen neuronalen Zelltypen fördern.
Undifferenzierte NPCs verwandeln sich in Embryoidkörper, die als serumfreie Embryoidkörper oder SFEBs bekannt sind, da den Medien Serum fehlt. Diese EBs ähneln der Morphologie eines sich entwickelnden Gehirns.
Übertragen Sie den Einsatz in eine Vertiefung, die DM-3 enthält.
DM-3 enthält Wachstumsfaktoren, die für die Aufrechterhaltung und das Wachstum von SFEBs unerlässlich sind.
Inkubieren, bis die SFEBs die gewünschte Größe erreicht haben.
Bereiten Sie nach zweiwöchiger Kultivierung der Zellen Sechs-Well-Platten mit 40-Mikron-Zellkultureinsätzen und 1 Milliliter DM1-Medium vor. Inkubieren Sie diese Platten mindestens vier Stunden lang, bevor Sie die kultivierten Zellen hinzufügen.
Sammeln Sie anschließend mit einer 200-Mikroliter-Weithalspipettenspitze zwei Wochen alte Zellaggregate mit etwa 20 Mikrolitern Medium. Übertragen Sie vier bis sechs Zuschlagstoffe mit minimaler Lösung auf jeden Einsatz. Entfernen Sie überschüssiges Material.
Bei diesem Schritt ist es wichtig, schnell und mit ruhiger Hand zu arbeiten. Beim Entfernen von Medium aus der Umgebung der SFEBs kann es vorkommen, dass sich die SFEBs aufgrund der Oberflächenspannung über die Lösung bewegen. Es ist in Ordnung, sie nach dem Entfernen des Mediums neu zu positionieren.
Sobald alle Aggregate auf die Inserts geladen sind, ändern Sie das Medium auf 1 Milliliter DM2 und fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen fort. Ersetzen Sie jeden zweiten Tag 3/4 des Mediums durch frisches Medium. Beginnen Sie nach 14-tägiger Kultivierung mit der Zugabe von DM3-Medium zu den Kulturen. Setzen Sie die Kultivierung für weitere 16 Tage fort, um die SFEBs wachsen zu lassen.