Generierung eines 3D-Co-Kulturmodells von humanen Hornhautfibroblasten und Neuronen

Nehmen wir menschliche Hornhautfibroblasten.

Übertragen Sie sie auf einen Membraneinsatz in einer Multiwell-Platte, die das Medium enthält.

Fügen Sie dem Membraneinsatz Medien hinzu. Inkubieren für die Adhärenz der Fibroblasten an der Einlage.

Ersetzen Sie anschließend das Medium durch Medien, die Vitamin C im Membraneinsatz und im Reservoir enthalten.

ausbrüten. Vitamin C regt die Fibroblasten an, eine extrazelluläre 3D-Matrix zu sezernieren und zusammenzusetzen.

Geben Sie eine humane Neuroblastom-Zellsuspension über die Fibroblasten.

Inkubieren, um die Adhäsion von Neuroblastomzellen zu ermöglichen.

Geben Sie nun Medien mit Retinsäure über die Zellen und ergänzen Sie das Reservoir mit frischen Medien.

ausbrüten. Retinsäure löst die Differenzierung der Neuroblastomzellen in neurale Vorläuferzellen aus.

Entfernen Sie anschließend das Medium. Führen Sie frisches Medium in das Reservoir ein. Geben Sie Medien, die einen neurotrophen Faktor enthalten, in die Membraneinlage und inkubieren Sie.

Neurotrophe Faktoren lösen die Differenzierung von Vorläuferzellen in Neuronen aus und erzeugen ein 3D-Co-Kulturmodell von menschlichen Hornhautfibroblasten und Neuronen.

Um 3D-Konstrukte zusammenzusetzen, durchlaufen und zählen Sie zunächst menschliche Hornhautfibroblasten. Säen Sie dann etwa 1 mal 10 zu den 6 HCFs auf eine Polycarbonat-Membraneinlage mit 0,4-Mikron-Poren. Gib 1,5 Milliliter frisches Medium auf die Oberseite des Konstrukts. Pipettieren Sie dann weitere 1,5 Milliliter des gleichen Mediums auf den Boden jedes Konstrukts.

Geben Sie nach 24 Stunden 1,5 Milliliter Medium, das mit 0,5 Millimolar Vitamin C ergänzt ist, auf die Ober- und Unterseite jedes Konstrukts. Inkubieren Sie drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid und fügen Sie jeden zweiten Tag frische Medien mit Vitamin C hinzu. Dadurch werden die Zellen dazu angeregt, ihre eigene extrazelluläre Matrix zu sezernieren und zusammenzusetzen. Nach drei Wochen fügen Sie 8 mal 10 zu den 3 humanen SH-SY5Y-Neuroblastomzellen auf den zuvor zusammengesetzten 3D-Konstrukten hinzu.

Es ist wichtig, in diesem Schritt die genaue Zellzahl zu berechnen und 24 Stunden zu warten, bevor die Zelldifferenzierung eingeleitet wird.

Nach 24-stündiger Inkubation wird die SH-SY5Y-Zelldifferenzierung eingeleitet, indem die Zellen mit 1,5 Millilitern EMEM mit 10 % FBS und 10 mikromolaren Retinsäure stimuliert werden. Geben Sie dann 1,5 Milliliter des Vitamin-C-haltigen Mediums auf den Boden des Konstrukts. Retinsäure ist lichtempfindlich, daher sollte dieser Schritt im Dunkeln durchgeführt werden.

Nach fünf Tagen, wenn die Zellen die Differenzierungsphase erreicht haben, geben Sie 1,5 Milliliter serumfreies Medium mit 2 nanomolaren BDNF und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum auf die Oberseite des Konstrukts. Geben Sie frisches, mit Vitamin C angereichertes Medium auf den Boden des Konstrukts. Kultivieren Sie die Zellen zwei weitere Tage lang, bevor sie für die weitere Analyse verarbeitet werden.