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Legen Sie einen Objektträger mit einer fixierten Gewebeprobe in einen Antigen-Retrieval-Puffer und erhitzen Sie ihn.
Die erhöhte Temperatur und der alkalische pH-Wert des Puffers brechen die fixierungsinduzierten Proteinvernetzungen auf und legen Antigen-Epitope frei.
Kühlen Sie den Objektträger ab, um hitzebedingte Gewebeschäden zu vermeiden, und spülen Sie ihn dann aus, um überschüssigen Puffer zu entfernen.
Tragen Sie eine hydrophobe Barriere auf und legen Sie den Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer.
Fügen Sie einen Puffer hinzu, der die Permeabilisierung blockiert. Das Detergens des Puffers permeabilisiert die Zellmembranen, und blockierende Proteine maskieren unspezifische Bindungsstellen, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren.
Entfernen Sie überschüssigen Puffer, fügen Sie einen metallkonjugierten Antikörpercocktail hinzu und inkubieren Sie, um die Antikörperbindung an spezifische Antigene zu ermöglichen.
Waschen Sie den Objektträger und entfernen Sie ungebundene Antikörper.
Fügen Sie einen metallkonjugierten Kernfleck hinzu, der in die Zellen eindringt und an die DNA bindet.
Spülen Sie überschüssigen Fleck ab und trocknen Sie den Objektträger.
Mit einem optischen Scanner erhalten Sie hochauflösende Bilder der strukturellen Merkmale des Gewebes, die bei der Interpretation von Daten aus der bildgebenden Massenzytometrie der gefärbten Probe helfen.
Beginnen Sie mit einem fünf Mikrometer großen vorbehandelten Gewebeschnitt, der über einen immunfärbefähigen Objektträger montiert ist. Legen Sie die Folien in einen Folien-Mailer.
Für die hitzeinduzierte Epitop-Entnahme oder HIER geben Sie HIER-Puffer in den Objektträger-Versandbehälter, bis das Gewebe vollständig eingetaucht ist. Legen Sie den Schiebeversand in eine Enttarnungskammer und starten Sie das Heizprogramm.
Legen Sie den Folienversand nach Beendigung des Programms in ein mit kaltem Wasser gefülltes Fach und lassen Sie ihn abkühlen. Spülen Sie die Objektträger mehrmals mit destilliertem Wasser aus, indem Sie das Volumen allmählich erhöhen.
Nehmen Sie die Folien aus dem Folienversand, und wischen Sie den überschüssigen Puffer ab. Um einen Verlust von Blockierungspuffer und Antikörpern zu verhindern, umschließen Sie das Gewebe mit einem hydrophoben Barrierestift.
Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang in einer maßgeschneiderten Feuchtigkeitskammer. Für unspezifische Verstopfungen fügen Sie den Objektträgern in der Feuchtigkeitskammer Blockierungspuffer hinzu. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit den überschüssigen Blockierungspuffer und lassen Sie den restlichen Puffer bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
Geben Sie die Antikörperlösung vorsichtig über das Gewebe und inkubieren Sie sie über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie den Objektträger nach der Inkubation 5 Minuten lang mit Triton-haltigem PBS. Spülen Sie den Objektträger zum Schluss zweimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS aus. Behandeln Sie nun das Gewebe mit dem Interkalatorfarbstoff und inkubieren Sie es in der Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für dreißig Minuten.
Waschen Sie den Objektträger nach der Inkubation fünf Minuten lang mit Wasser in HPLC-Qualität und trocknen Sie ihn dreißig Minuten lang in einem Exsikkator.
Sobald die Folie trocken ist, scannen Sie mit einem Flachbett-Dokumentenscanner mit einer Auflösung von mindestens 1200 Punkten pro Zoll.