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Beginnen Sie mit einem immobilisierten Maushirnschnitt, der in einer Aufnahmekammer des Elektrophysiologie-Setups platziert wird, die mit einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt ist, um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu erhalten.
Der Aufbau besteht aus einer vormontierten, mit kationischer Lösung gefüllten Aufzeichnungsmikropipette, die mit einem Verstärker und einer Druckkontrolleinheit verbunden ist.
Lokalisieren Sie unter einem Mikroskop ein Neuron und positionieren Sie die Mikropipette in der Nähe.
Üben Sie positiven Luftdruck aus, um Schmutz zu entfernen.
Bewegen Sie die Mikropipette in Richtung des Neurons, bis sich ein Grübchen auf der Membran bildet, das auf eine neuronale Nähe hinweist.
Wenden Sie einen schwachen Sog an, um ein kleines Membranpflaster in die Mikropipette zu ziehen.
Dadurch entsteht eine dichte Abdichtung, die den Widerstand der Mikropipette erhöht und eine stabile Abdichtung bestätigt.
Halten Sie das Potenzial der Zelle auf einem physiologischen Ruhepotenzial für die Zellstabilität.
Üben Sie dann einen kurzen, starken Sog aus, um die Patch-Membran aufzubrechen und eine direkte Verbindung mit dem Inneren der Zelle herzustellen.
Diese Ganzzellkonfiguration ist bereit für die Aufzeichnung der neuronalen elektrischen Aktivität.
Beginnen Sie mit dem Feinfokussierrad des Mikroskops mit dem Fokussieren, während Sie die Mikropipette allmählich absenken. Fokussieren Sie immer zuerst nach unten und senken Sie dann die Mikropipette auf die Fokusebene ab, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikropipette nicht abrupt in die Scheibe eindringt. Wenn die Mikropipette mit der Oberfläche der Scheibe in Berührung kommt, verlangsamen Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators auf den mittleren bis niedrigen Modus. Üben Sie vorsichtig leichten positiven Druck aus, um Schmutz auf dem Weg zu entfernen.
Nähern Sie sich dann der Zelle, indem Sie entweder mit den Drehreglern X, Y und Z wechseln oder sich diagonal nähern, wobei beide XZ-Achsen durch die Drehung des Drehknopfes der Z-Achse geändert werden. Wenn sich die Mikropipette nahe genug an der Zelle befindet, erscheint ein Grübchen auf der Zelloberfläche.
Saugen Sie nun schwach und kurz durch das Rohr, das mit dem Saugrohr des Pipettenhalters verbunden ist, um eine Abdichtung zu schaffen. Während sich ein Gigaseal bildet, verwenden Sie den computergesteuerten Verstärker-Commander, um das Haltepotenzial der Zellen auf das physiologische Ruhepotenzial zu bringen, um plötzliche Veränderungen zu verhindern, sobald die Membran gerissen ist. Nachdem sich der Gigaseal gebildet hat, kompensieren Sie die schnelle oder langsame Kapazität.
Hier ist es sehr wichtig, dass der ausgeübte Sog nicht zu stark ist, da sonst die Membran vor dem Aufbau der Abdichtung reißen kann.
Wenn die Dichtung stabil bleibt und über 1 Gigaohm liegt, üben Sie einen kurzen und starken Sog aus, um die Plasmamembran zu zerreißen.
Die Saugleistung muss kurz sein und ist stärker als der Druck, der beim Einrichten einer Versiegelung ausgeübt wird, um die Membran ordnungsgemäß zu zerreißen und eine stabile Ganzzellenkonfiguration zu erreichen.