Anlegen von Rauschströmen an Neuronen des medialen vestibulären Kerns mit der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik

Nehmen Sie ein Hirnstammschnitt der Maus, der den medialen vestibulären Kern (MVN) enthält.

Sichern Sie die Scheibe in einer Aufnahmekammer, die mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt ist, um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu erhalten.

Visualisieren Sie den Schnitt unter einem Mikroskop, um MVN-Neuronen zu lokalisieren.

Üben Sie positiven Druck aus, um eine Mikropipette, die mit einer intrazellulären Umgebungslösung gefüllt ist, durch das Gewebe zu befördern.

Wenn die Pipette mit einem Neuron in Kontakt kommt, bildet die neuronale Membran Grübchen.

Üben Sie Unterdruck aus, um einen kleinen Membranteil anzusaugen, wodurch eine dichte Abdichtung entsteht.

Legen Sie als Nächstes Unterdruckimpulse an, um die Membran zu zerreißen und eine kontinuierliche Verbindung zwischen dem Neuron und der Pipette herzustellen.

Wenden Sie zufällige Rauschamplituden auf das Neuron an und identifizieren Sie eine unterschwellige Amplitude, oberhalb derer das Rauschen neuronales Feuern induziert.

Wenden Sie schließlich eine Reihe von elektrischen Stimuli auf das Neuron an, kombiniert mit der unterschwelligen zufälligen Rauschamplitude.

Messen Sie den neuronalen Gewinn – die Fähigkeit des Neurons, seine Schussreaktion auf die Reize in Gegenwart von Lärm zu modulieren.

Für die Elektrophysiologie der Ganzzell-Patch-Klemme ziehen Sie zunächst Mikropipetten mit einem Endwiderstand, der zwischen 3 und 5 Megaohm liegt, wenn sie mit einer internen Lösung auf Kaliumbasis gefüllt sind, und legen Sie sie in das Bad. Um Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von einzelnen Neuronen im MVN zu erhalten, übertragen Sie eine einzelne Gewebescheibe aus der Inkubationskammer in die Aufzeichnungskammer eines elektrophysiologischen Standardaufbaus und verwenden Sie einen Nylonfaden auf einem U-förmigen Gewicht, um die Scheibe zu sichern.

Die Aufzeichnungskammer wird kontinuierlich mit karbogeniertem aCSF bei 25 Grad Celsius und einer Flussrate von drei Millilitern pro Minute perfundiert und eine Mikropipette mit interner Lösung gefüllt. Üben Sie mit einer Pipette einen kleinen Überdruck aus, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzudrücken. Lokalisieren Sie mit einem Objektiv mit niedrigerer Leistung das MVN, bevor Sie auf eine hohe Leistung umschalten, um einzelne Neuronen innerhalb des MVN zu lokalisieren.

Bevor Sie mit der Pipette in das Gewebe eindringen, üben Sie einen kleinen Überdruck aus, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzudrücken, und verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette in Richtung des ausgewählten Neurons zu bewegen. Auf der neuronalen Membran sollte sich ein kleines Grübchen bilden. Lassen Sie den Überdruck ab und üben Sie einen kleinen Unterdruck aus.

Sobald eine Abdichtung von einem Gigaohm erreicht ist, üben Sie durch die Saugöffnung einen sanften, kurzen und scharfen Unterdruck auf den Pipettenhalter aus, um die Membran zu zerreißen und eine Ganzzellenkonfiguration zu erzeugen. Anschließend erhalten Sie Aufzeichnungen der gesamten Zelle von Stromzangen gemäß Standardprotokollen.

Um stochastisches und sinusförmiges Rauschen auf einzelne Neuronen des medialen vestibulären Kerns anzuwenden, stellen Sie den Amplitudenbereich von 3 bis 24 Pikoampere ein, um die neuronale Schwelle und die Feuerrate zu bestimmen, und gruppieren Sie die niedrigere und höhere Stimulusintensität, um die sensorische Schwelle zu bestimmen.

Berechnen Sie als Nächstes die durchschnittliche Zündrate über den Zeitraum von 10 Sekunden, in dem der depolarisierende Stromschritt für jeden einzelnen Strompegel injiziert wird. Verwenden Sie die Werte für die durchschnittliche Auslöserate, um ein Diagramm für die Auslöserate im Vergleich zum aktuellen Diagramm zu erstellen. Führen Sie dann eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Gradienten der Linie der besten Anpassung zu bestimmen und den neuronalen Gewinn zu bestimmen.