JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:57 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie retinale Ganglienzellen des Zebrafisches, die auf beschichteten Deckgläsern kultiviert wurden.
Diese Zellen exprimieren einen genetisch kodierten Biosensor, der das redoxempfindliche grün fluoreszierende Protein roGFP2 produziert, das mit einem Wasserstoffperoxid-empfindlichen Enzym, Orp1, fusioniert ist.
Übertragen Sie das Deckglas mit dem Medium in eine Kammer für die Bildgebung lebender Zellen und legen Sie die Kammer auf ein inverses Mikroskop.
Ersetzen Sie das Medium durch serumfreie Medien, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
Aufgrund des niedrigen Wasserstoffperoxidgehalts bleibt roGFP2 in seiner reduzierten Konformation.
Stimulieren Sie den Biosensor sequentiell bei Wellenlängen von 405 und 480 nm.
Reduziertes roGFP2 weist einen Anregungspeak bei 480 nm auf.
Wechseln Sie zu einem Wasserstoffperoxid-haltigen Medium.
Wasserstoffperoxid dringt in die Zellen ein und reagiert mit Orp1, wodurch roGFP2 oxidiert wird.
Stimulieren Sie den Biosensor erneut.
Oxidiertes roGFP2 zeigt eine Fluoreszenzzunahme bei 405 nm und eine Abnahme bei 480 nm.
Berechnen Sie das Fluoreszenzintensitätsverhältnis.
Eine Erhöhung des Verhältnisses weist auf einen erhöhten zellulären Wa
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