JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:57 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie retinale Ganglienzellen des Zebrafisches, die auf beschichteten Deckgläsern kultiviert wurden.
Diese Zellen exprimieren einen genetisch kodierten Biosensor, der das redoxempfindliche grün fluoreszierende Protein roGFP2 produziert, das mit einem Wasserstoffperoxid-empfindlichen Enzym, Orp1, fusioniert ist.
Übertragen Sie das Deckglas mit dem Medium in eine Kammer für die Bildgebung lebender Zellen und legen Sie die Kammer auf ein inverses Mikroskop.
Ersetzen Sie das Medium durch serumfreie Medien, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
Aufgrund des niedrigen Wasserstoffperoxidgehalts bleibt roGFP2 in seiner reduzierten Konformation.
Stimulieren Sie den Biosensor sequentiell bei Wellenlängen von 405 und 480 nm.
Reduziertes roGFP2 weist einen Anregungspeak bei 480 nm auf.
Wechseln Sie zu einem Wasserstoffperoxid-haltigen Medium.
Wasserstoffperoxid dringt in die Zellen ein und reagiert mit Orp1, wodurch roGFP2 oxidiert wird.
Stimulieren Sie den Biosensor erneut.
Oxidiertes roGFP2 zeigt eine Fluoreszenzzunahme bei 405 nm und eine Abnahme bei 480 nm.
Berechnen Sie das Fluoreszenzintensitätsverhältnis.
Eine Erhöhung des Verhältnisses weist auf einen erhöhten zellulären Wasserstoffperoxidspiegel hin.
Überprüfen Sie die Zellen am Tag der Bildgebung unter dem Mikroskop, um das Wachstum der RGC-Axone zu validieren. Für die Bildgebung lebender Zellen übertragen Sie die Deckgläser aus der Kulturschale in eine Kammer für die Bildgebung lebender Zellen. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem DIC-Objektiv, einem OG590-Langpass-Rotfilter und einer EM-CCD-Kamera ausgestattet ist.
Ersetzen Sie vor der Bildgebung das ZFCM+-Medium durch ZFCM-. Nachdem Sie die Zellen mit dem 10-fachen Objektiv positioniert haben, nehmen Sie Bilder mit 60-facher Vergrößerung mit einem Öl-Immersionsobjektiv auf. Verwenden Sie eine zusätzliche 1,5-fache Vergrößerung.
Erfassen Sie zuerst DIC-Bilder und dann roGFP2-Orp1 mit einem entsprechenden Filtersatz. Nachdem Sie die ersten Bilder aufgenommen haben, tauschen Sie Medien mit Medien aus, die unterschiedliche Behandlungslösungen enthalten. Das Medium sollte alle 30 Minuten der Bildgebung gewechselt werden, um Änderungen des pH-Werts und der Osmolarität zu vermeiden.