Etablierung einer Ganzzellkonfiguration für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung von Hirnschnitten
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:44 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Stimulationspipette mit roten, kalziumunempfindlichen Fluorophoren in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF).
Positionieren Sie die Pipette in der Nähe des Zielneurons in einer Hippocampus-Schnitte.
Platzieren Sie eine Patch-Pipette mit einer Aufzeichnungselektrode, die in einem Elektrolyten gebadet ist, der rote Calcium-unempfindliche und grüne Calcium-Indikator-Fluorophore enthält, in der Nähe des Ziels.
Üben Sie konstanten Überdruck aus, um die Gewebeoberfläche kurzzeitig zu stören und die Nähe zum Ziel anzuzeigen.
Wenn sich das Grübchen auf der neuronalen Membran bildet, lassen Sie den Druck ab, um eine Versiegelung zu bilden.
Üben Sie Unterdruck aus, um die Dichtung festzuziehen.
Stabilisieren Sie das Membranpotential bei einer konstanten negativen Spannung.
Fahren Sie mit Unterdruck fort, um die Membran zu brechen, damit sich die fluorophorhaltigen Elektrolyte im Neuron ausbreiten können.
Visualisieren Sie die rote Fluoreszenz der dendritischen Zielwirbelsäule und richten Sie die Stimulationspipette in der Nähe aus.
Wenden Sie elektrische Impulse an, um die Kalziumkanäle zu öffnen.
Verwenden Sie die Zwei-Photonen-Mikroskopie, um vorübergehende Änderungen des Kalziumspiegels sichtbar zu machen, die durch grüne Fluoreszenz angezeigt werden.
In diesem Schritt wird eine Hippocampus-Scheibe in ein Bad unter dem Objektiv eines Laser-Scanning-Zwei-Photonen-Mikroskops überführt. Perfundieren Sie das Bad kontinuierlich mit sauerstoffhaltigem ACSF normal. Verwenden Sie dann die Infrarot-Differenzinterferenzkontrastmikroskopie, um eine interessierende Zelle anhand ihrer Größe, Form und Position zu lokalisieren.
Füllen Sie danach eine stimulierende Pipette mit einer normalen ACSF-Lösung, die das rote Fluorophor enthält. Senken Sie es auf das Segment, sodass sich die Spitze im selben Bereich wie die gewünschte Zelle befindet. Füllen Sie anschließend die Patch-Pipette mit Patch-Lösung und befestigen Sie sie am Kopftisch. Platzieren Sie es so über dem Segment, dass sich seine Spitze direkt über der gewünschten Zelle befindet.
Setzen Sie anschließend eine Spritze in den Dreiwege-Absperrhahn ein und verbinden Sie sie über ein Kunststoffröhrchen mit der Patchpipette. Injizieren Sie konstanten Überdruck in die Patch-Pipette und halten Sie den Absperrhahn in geschlossener Position. Senken Sie die Patch-Pipette ab, bis sie sich ganz oben auf der Zielzelle befindet. Bei Kontakt mit der Zellmembran den Druck durch Drehen des Absperrhahns in die offene Stellung nehmen.
Üben Sie dann mit einer leeren Spritze, die in den Absperrhahn eingesetzt wird, einen leichten Unterdruck auf die Patch-Pipette aus, bis der Pipettenwiderstand 1 Gigaohm erreicht. Klemmen Sie die Zelle im Membrantestfenster der Datenerfassungssoftware bei minus 60 Millivolt ein. Üben Sie weiterhin Unterdruck aus, bis der Pipettenwiderstand abnimmt und die gesamte Zellkonfiguration erreicht ist.
Um dendritische Kalziumtransienten aufzuzeichnen, die durch elektrische Stimulation induziert werden, lokalisieren Sie einen Dendriten von Interesse mithilfe des roten Fluoreszenzsignals. Setzen Sie die stimulierende Pipette auf die Oberfläche der Scheibe über dem gewünschten Dendriten. Senken Sie die Stimulationspipette langsam 10 bis 15 Mikrometer vom Dendriten ab, um die Bewegung zu minimieren, um eine Störung der Ganzzellkonfiguration zu vermeiden.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Visualisierung von Kalziumtransienten in hippocampalen Neuronen mittels Zweiphotonen-Mikroskopie beschrieben. Die Technik beinhaltet die Verwendung von Stimulations- und Patch-Pipetten, um Zielneurone zu manipulieren und von ihnen aufzuzeichnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Die Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die neuronale Funktion.
- Mithilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie lässt sich lebende Neurone hochauflösend abbilden.
- Das Verständnis der Kalziumdynamik kann Einblicke in das Verhalten von Neuronen liefern.
- Patch-Clamp-Techniken sind unerlässlich, um zelluläre Eigenschaften zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Um Kalziumtransienten in dendritischen Dornfortsätzen von hippocampalen Neuronen sichtbar zu machen.
- Um die Anwendung kombinierter elektrophysiologischer und bildgebender Verfahren zu demonstrieren.
- Um das Verständnis synaptischer Aktivität und neuronaler Signalübertragung zu vertiefen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von hippocampalen Schnitten für Experimente.
- Verwendung von Stimulations- und Patch-Pipetten für gezielte Manipulationen.
- Anwendung der Zweiphotonenmikroskopie zur Abbildung von Kalziumkonzentrationen.
- Aufzeichnung elektrischer Aktivität und Kalziumtransienten in Neuronen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Kalziumtransienten als Reaktion auf elektrische Stimulation.
- Nachweis der Wirksamkeit der kombinierten Techniken.
- Identifizierung spezifischer dendritischer Dornen, die an synaptischer Aktivität beteiligt sind.
- Erkenntnisse über die Dynamik der Kalziumsignalgebung in Neuronen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung neuronaler Kalziumdynamik.
- Die Kombination von Elektrophysiologie mit Bildgebung vertieft das Verständnis der neuronalen Funktion.
- Dieser Ansatz kann auf verschiedene Untersuchungen in der Neurowissenschaft angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Ganzzell-Patch-Clamp in Kombination mit Calcium-Bildgebung mittels Zweiphotonenmikroskopie ermöglicht eine präzise Untersuchung der neuronalen Kalziumdynamik in Gehirnschnitten und unterstützt die mechanistische Entwicklungsrisikominimierung in der frühen zentralnervösen Wirkstoffforschung. Diese Methode liefert quantitative, hochauflösende Daten zur synaptischen Funktion und Signalübertragung und trägt so zur Zielvalidierung und Pfadanalyse bei. Die Integration in Entdeckungsworkflows erhöht die Vorhersagesicherheit für neuropharmakologische Wirkstoffportfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Messung neuronaler Kalziumtransienten zur funktionellen Zielstrukturvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Aufklärung synaptischer Signalwege.
- Liefert quantitative Daten zur Entscheidungsfindung bei der Weiterentwicklung oder Einstellung von Projekten in CNS-Zielstrukturenportfolios.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Hirnschnitt-Systeme für die anschließende Wirkstoff-Screening.
- Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte der Kalziumsignalisierung zur Assay-Standardisierung.
- Erleichtert die zuverlässige Bewertung von Kandidatenmolekülen, die die neuronale Erregbarkeit beeinflussen.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt die neuronale Aktivität in vitro mit krankheitsrelevanten synaptischen Biomarkern ab.
- Unterstützt die Kontinuität von der mechanistischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in ZNS-Modellen.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung neuroaktiver Substanzen basierend auf funktionellen Ergebnissen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode liegt im Schnittpunkt zwischen früher Entdeckung und präklinischer Forschung und verbindet mechanistische Studien mit translativer Validierung in der CNS-Wirkstoffentwicklung.
- Entdeckungsbiochemie Liefert direkte Belege für die Hypothesenprüfung neuronaler Signalübertragungsmechanismen.
- Screening: Bietet quantitative, reproduzierbare Calcium-Bildgebungsdaten für die Bereitschaft von Assays.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich synaptischer Antworten unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung Verknüpft in-vitro-Befunde mit krankheitsrelevanten neuronalen Aktivitätsmustern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für die Untersuchung unterschiedlicher Ziele und Signalwege im zentralen Nervensystem.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung zentralnervöser Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Standardisiert und skaliert hochauflösende neuronale Assays für die Nutzung über Projekte hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Portfolio-Priorisierung und Kapitalallokation, indem robuste funktionelle Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung neuropharmakologischer Assets.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie und fortgeschrittenen Bildgebungstechniken.
- Benötigt Zugang zu Zwei-Photonen-Mikroskopie und Patch-Clamp-Ausrüstung.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung zwischen den Teams, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Kann Anpassungen für verschiedene neuronale Subtypen oder Hirnregionen erfordern.
- Hängt von der Gewebequalität und der Leistungsfähigkeit der Fluorophore für optimale Ergebnisse ab.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026