Elektrophysiologische Aufzeichnungen zur Beurteilung neuronaler Regenerationen in co-kultivierten Rückenmarksschnitten
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 4:21 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein polymerbeschichtetes Multi-Elektroden-Array (MEA) mit co-kultivierten embryonalen Rückenmarksschnitten, die in zwei separaten Zonen positioniert sind und eine gleichzeitige Aufzeichnung von beiden Schnitten ermöglichen.
Der Schnitt zeigt regenerierte neuronale Verbindungen im zuvor läsionierten Bereich.
Platzieren Sie das MEA in einer Aufnahmekammer, die eine extrazelluläre Lösung enthält, die reich an Ionen und Nährstoffen ist, um das Überleben der Neuronen zu erhalten.
Ermöglichen Sie es dem System, sich zu stabilisieren, was die Anpassung und Kommunikation der Neuronen erleichtert.
Neuronen kommunizieren über elektrische Signale, sogenannte Aktionspotentiale, die von den nahegelegenen Elektroden im MEA aufgezeichnet werden.
Einzelne Signale von jeder Elektrode werden kombiniert, so dass von jeder Scheibe ein elektrisches Signal erzeugt wird.
Tauschen Sie die extrazelluläre Lösung regelmäßig aus, um die Stabilität der Neuronen zu erhalten.
Fügen Sie eine extrazelluläre Lösung mit Inhibitoren hinzu, die hemmende Neurotransmitterrezeptoren auf neuronalen Membranen blockieren und die Neuronen für eine längere Zeit aktiv halten.
Vergleichen Sie die elektrische Aktivität beider Schichten. Ein synchronisiertes elektrisches Signal zwischen den beiden Schichten bestätigt die synaptischen Verbindungen und die erfolgreiche neuronale Regeneration.
Legen Sie eine Petrischale mit einem beschichteten Mikroelektrodenarray unter ein Stereomikroskop. Bringen Sie das Array in den Fokus und zentrieren Sie ein sechs Mikroliter großes Tröpfchen Hühnerplasma auf dem Elektrodenarray. Schieben Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig zwei Rückenmarksabschnitte mit den Bauchseiten zueinander in das Plasmatröpfchen.
Fügen Sie als nächstes acht Mikroliter Thrombin um das Hühnerplasma-Tröpfchen hinzu. Mischen und verteilen Sie dann mit der Pipettenspitze vorsichtig die Mischung aus Hühnerplasma und Thrombin. Kurz bevor das Hühnerplasma-Thrombin-Gemisch zu fadenziehend wird und zu gerinnen beginnt, saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit an. Verschließen Sie dann die Petrischale und stellen Sie sie in eine befeuchtete Kammer.
Stellen Sie die Kammer für etwa eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 10 Mikroliter Nährmedium in die Probe. Verschließen Sie die Petrischale und stellen Sie sie für weitere 45 Minuten in den Inkubator. Legen Sie dann jede der Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppen in ein Rollenrohr und fügen Sie drei Milliliter Nährmedium hinzu. Schließen Sie den Deckel fest und setzen Sie das Rollrohr in die Rolltrommel ein. Drehen Sie die Trommel im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 1 bis 2 U/min.
Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette mit Gummispitze die Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppen aus dem Rollenrohr und legen Sie sie unter einem Stereomikroskop in eine Petrischale. Bringen Sie das Gewebe in den Fokus und vergewissern Sie sich, dass die beiden Scheiben verschmolzen sind. Halten Sie dann die Baugruppe ruhig und platzieren Sie eine Skalpellklinge in der Rille des Multielektrodenarrays in der Nähe der Gewebeschnitte. Halten Sie das Skalpell eher waagerecht und heben Sie dann den Skalpellgriff nach oben, aber lassen Sie die Skalpellklinge so in der Rille des Arrays bleiben, dass die Klinge von der Basis zur Spitze rollt, das Gewebe durchschneidet und die Rille bedeckt.
Durchtrennen Sie bei Bedarf alle Gewebereste mit einer 25-Gauge-Nadelspitze. Arbeiten Sie nur im Bereich innerhalb der Rille und berühren Sie nicht die zarten Kanten. Setzen Sie die Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppen wieder in das Rollrohr ein und geben Sie drei Milliliter frisches Nährmedium in die Kulturen. Legen Sie dann das Rollenrohr wieder auf die Walzentrommel im Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Montieren Sie eine Multi-Elektroden-Array-Kulturbaugruppe in einer Aufnahmekammer und tragen Sie etwa 500 Mikroliter extrazelluläre Lösung auf das Array auf. Montieren Sie dann die Baugruppe auf dem Mikroskop. Warten Sie 10 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat, und zeichnen Sie dann 10 Minuten lang die grundlegende spontane Aktivität jeder der Aktivitätserkennungselektroden auf. Wiederholen Sie die Aufnahmen insgesamt zweimal.
Um stabile extrazelluläre Bedingungen zu gewährleisten, tauschen Sie die extrazelluläre Lösung nach jeder Aufnahmesitzung aus. Falls gewünscht, enthemmen Sie das Netzwerk, indem Sie eine extrazelluläre Lösung auftragen, die ein Mikromolar Strychnin und 10 Mikromolar Gabazin enthält, und warten Sie mindestens zwei Minuten, bevor Sie die elektrische Aktivität aufzeichnen.
Übersicht
Diese Studie demonstriert eine Methode zur Aufzeichnung elektrischer Aktivität aus koinkubierten embryonalen Rückenmarkschnitten unter Verwendung eines polymerbeschichteten Multielektrodenarrays (MEA). Der Ansatz ermöglicht die Beurteilung neuraler Regeneration und synaptischer Verbindungen nach einer Verletzung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neurale Regeneration
Hintergrund
- Mehrelektrodenarrays werden verwendet, um elektrische Signale von Neuronen aufzuzeichnen.
- Durch die Kokultivierung von Rückenmarkschnitten lässt sich die Untersuchung neuronaler Verbindungen ermöglichen.
- Die Aufrechterhaltung der extrazellulären Bedingungen ist entscheidend für die Gesundheit der Neuronen.
- Hemmende Neurotransmitterrezeptoren können blockiert werden, um die neuronale Aktivität zu verstärken.
Zweck der Studie
- Untersuchung der elektrischen Aktivität regenerierter neuronaler Verbindungen.
- Vergleich der Aktivität zwischen zwei Schnitten des Rückenmarks.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Kultivierung und Ableitung neuronaler Zellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Multielektrodenarrays mit kokultivierten Rückenmarkschnitten.
- Aufzeichnung elektrischer Signale mittels des MEA in einer kontrollierten Umgebung.
- Regelmäßiger Austausch der extrazellulären Lösungen zur Sicherstellung der Stabilität.
- Anwendung von Inhibitoren zur Steigerung der neuronalen Aktivität.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Aufzeichnung synchronisierter elektrischer Signale zwischen Schnitten.
- Bestätigung synaptischer Verbindungen durch Analyse elektrischer Aktivität.
- Nachweis wirksamer neuronaler Regeneration in verletzten Bereichen.
- Einrichtung einer stabilen Aufzeichnungsumgebung für neuronale Kulturen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht eine detaillierte Analyse der neuronalen Regeneration.
- Die Blockade inhibitorischer Rezeptoren kann die neuronale Aktivität verlängern.
- Dieser Ansatz kann auf weitere Untersuchungen der neuronalen Vernetzung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Beurteilung der funktionellen neuronalen Regeneration in kokultivierten Rückenmarkschnitten mithilfe von Multielektrodenarrays bietet ein physiologisch relevantes Modell zur Bewertung neuroregenerativer Therapeutika. Dieser Ansatz ermöglicht eine Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium, indem synchronisierte elektrische Aktivität als funktioneller Parameter für die synaptische Wiederanbindung gemessen wird. Er trägt zur mechanistischen Risikominimierung in Entdeckungsplattformen bei, die auf die Reparatur des zentralen Nervensystems und die axonale Regeneration ausgerichtet sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der funktionellen synaptischen Konnektivität zwischen neuralen Geweben.
- Operationaler Wert: Liefert einen reproduzierbaren elektrophysiologischen Endpunkt zur Aufklärung von Signalwegen und Beurteilung der Zielstrukturenbindung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch Korrelation der Wirkstoffbehandlung mit der Wiederherstellung synchronisierter neuronaler Aktivität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantifizierbare extrazelluläre Feldpotentiale aus Kokulturen von Schnitten für die Wirkstoffscreening.
- Reproduzierbarkeit: Stabilisierte Ableitbedingungen und regelmäßiger Lösungsaustausch gewährleisten eine konsistente Grundaktivität über die Replikate hinweg.
- Skalierbarkeit: Das Multielektrodenarray-Format ermöglicht die parallele Überwachung mehrerer Kulturpräparate und unterstützt dadurch ein mittleres Durchsatz-Screening.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert organotypische Spinale-Mark-Kokulturen, um die Regeneration in einer verletzungsähnlichen Umgebung zu untersuchen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsphasenbasierte Zielvalidierung mit der präklinischen Wirksamkeitsprüfung durch funktionelle elektrophysiologische Endpunkte.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der Wiederherstellung synchronisierter elektrischer Aktivität als Biomarker der neuronalen Reparatur.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Bereich der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitsubstanzen ein, in dem die funktionelle Validierung neuroregenerativer Mechanismen vor der Wirksamkeitsprüfung in vivo erfolgt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung pro-regenerativer Verbindungen durch Messung der Wiederherstellung der elektrischen Synchronität zwischen ausgeschnittenen Geweben.
- Screening: Bietet einsatzbereite, stabile neuronale Netzwerke mit quantifizierbaren elektrophysiologischen Ausgangssignalen zur Bewertung von Substanzbibliotheken.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich elektrischer Aktivitätsmuster vor und nach der Behandlung, um funktionelle Erholung und Netzwerkreintegration zu beurteilen.
- Translationale Forschung: Stellt ein krankheitsrelevantes System bereit, das die Axonviabilität und synaptische Funktion für eine präklinische Kontinuität erhält.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare elektrophysiologische Plattform für iterative Tests über mehrere Zielstrukturen und Wirkmodi hinweg in Programmen zur Reparatur des zentralen Nervensystems.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem molekulare Interventionen mit der funktionellen Wiederherstellung neuronaler Netzwerke verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Liefert standardisierte, stimuliunabhängige elektrophysiologische Messwerte mit minimaler Variabilität zwischen verschiedenen Kulturen.
- Strategischer Wert: Verringert das Risiko spätzeitiger Fehlschläge, indem zielvermittelte Effekte auf die neuronale Vernetzung vor Tierversuchen bestätigt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die objektive, datengestützte Priorisierung neuroregenerativer Kandidaten basierend auf funktioneller elektrophysiologischer Wiederherstellung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie, Gewebekultur und im Umgang mit Multielektrodenarrays.
- Benötigt stabile Inkubation, Lösungsaustausch und Umweltkontrollsysteme für Langzeitaufnahmen.
- Erfordert die Standardisierung der Schnittplatzierung, Läsionsmodellierung und Stimulationsprotokolle zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Die Anpassung an humanes Gewebe oder Neuronen aus Krankheitsmodellen kann eine Optimierung der Reifungs- und Überlebensbedingungen erfordern.
- Auf akute bis subakute Regenerationsphasen beschränkt; für chronische Modelle kann eine verlängerte Kultivierungsunterstützung notwendig sein.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026