JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:29 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein Deckglas mit einer 1D-gemusterten neuronalen Kultur.
Die Neuronen sind mit einem Kalziumindikatorfarbstoff beladen, der bei Kalziumbindung fluoresziert.
Übertragen Sie das Deckglas in eine Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungskammer, die eine extrazelluläre Aufzeichnungslösung enthält.
Montieren Sie einen Halter mit zwei parallelen Drahtelektroden, die durch einen Abstand voneinander getrennt sind.
Drehen Sie den Halter um und positionieren Sie ihn über der neuronalen Kultur, wobei die Elektroden in die Aufnahmelösung eingetaucht sind.
Schließen Sie die Elektroden an einen Verstärker an. Wenden Sie eine gepulste bipolare Rechteckwelle ohne Gleichstrom an, um ein gleichmäßiges unidirektionales elektrisches Feld über die Neuronen zu erzeugen, ohne Verletzungen zu verursachen.
Das erzeugte elektrische Feld regt die Neuronen an und löst ein Aktionspotential aus.
Das Aktionspotential wandert entlang des Axons, aktiviert die spannungsgesteuerten Kalziumkanäle und verursacht einen Kalziumeinstrom in das Neuronenterminal. Darüber hinaus werden Neurotransmitter in die Synapse freigesetzt, die die synaptische Übertragung erleichtern.
Nach dem Einstrom von Kalziumionen binden diese Ionen an den intrazellulären Farbstoff und fluoreszieren, was auf neuronale Aktivität als Reaktion auf elektrische Stimulation hinweist.
Legen Sie vor einer elektrischen Stimulation das sitzende Deckglas in eine Bildgebungskammer. Um die Zellen mit einem elektrischen Feld konstanter Richtung zu stimulieren, verwenden Sie zwei parallele Elektroden, die 11 Millimeter voneinander entfernt sind und sich an gegenüberliegenden Seiten der Kultur befinden, die auf den 13-Millimeter-Deckgläsern plattiert sind. Bauen Sie dann die Bildgebungskammer für die Kultur und den passenden Elektrodenhalter so zusammen, dass die Drahtelektroden in das extrazelluläre Medium eingetaucht und einen Millimeter über der Kultur positioniert werden.
Schließen Sie dann das einzelne Elektrodenpaar an den Operationsverstärker an, der das Signal des Generators verstärkt. Legen Sie einen einzelnen Impuls einer bipolaren Rechteckwelle mit einer Einschaltdauer von 50 % und einer Amplitude von 22 Volt an. Verwenden Sie eine bipolare Welle ohne Gleichstromanteil, um eine Elektrolyse zu vermeiden, die an den Elektroden auftreten kann. Wenden Sie den Impuls an, der von 10 Mikrosekunden bis vier Millisekunden dauert, um eine effektive Stimulation zu gewährleisten, aber Zellverletzungen zu vermeiden.