Messung des Glutamatspiegels im Gehirn unter Narkose bei neugeborenen Ferkeln mit einem Mikroelektrodenarray

Befestigen Sie ein anästhesiertes neonatales Ferkel an einem stereotaktischen Rahmen.

Mache einen Schnitt in der Mittellinie, um den Schädel freizulegen.

Entferne einen Teil des Schädels und dann die Dura, um Zugang zum Gehirn zu erhalten.

Befestigen Sie ein Mikroelektrodenarray (MEA) am stereotaktischen Rahmen.

Die MEA besteht aus einer starren Welle und Aufzeichnungsstellen, einschließlich Glutamat-empfindlichen Stellen, die mit Glutamatoxidase beschichtet sind, und Sentinel-Stellen, die mit einer inaktiven Proteinmatrix beschichtet sind.

Positionieren Sie die MEA vertikal über der Operationsstelle und platzieren Sie eine Pseudo-Referenzelektrode unter der Kopfhaut, um eine stabile Basisspannungsreferenz zu erhalten.

Führen Sie das MEA in die interessierende Gehirnregion ein und initiieren Sie die Messung.

Die Glutamatoxidase an den Aufzeichnungsstellen wandelt extrazelluläres Glutamat im Gehirn in Wasserstoffperoxid um, das an der Elektrodenoberfläche elektrochemisch oxidiert und Strom erzeugt.

Die Sentinel-Standorte messen Hintergrundgeräusche.

Normalisieren Sie die Signale der glutamatempfindlichen Stelle auf die Signale der Sentinel-Stelle, um den Glutamatspiegel im Gehirn unter Narkose zu messen.

Beginne mit einem 4 bis 6 Zentimeter großen Schnitt in der Mittellinie entlang des Schädels und sei vorsichtig, um zu vermeiden, dass der Schädel mit dem Skalpell eingeritzt wird. Sobald der Schnitt gemacht ist, verwenden Sie eine sanfte Retraktion und eine stumpfe Dissektion, um die Kopfhaut vom Schädel abzuheben.

Schrubben Sie anschließend den Schädel vorsichtig mit einem Mullkissen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen und die Nahtlinien freizulegen. Bestimmen Sie dann den vorgesehenen Ort für die Kraniotomie. Wenn der interessierende Bereich verdeckt bleibt, reflektieren Sie die Kopfhaut weiter.

Verwenden Sie nun einen chirurgischen Bohrer, um ein Kraniotomiefenster zu erstellen, das etwa 0,25 Quadratzentimeter über der interessierenden Struktur liegt. Achten Sie darauf, die Dura oder das darunter liegende Gehirn nicht zu verletzen. Verwenden Sie bei Bedarf feine chirurgische Instrumente, um die Dura über dem Hirngewebe zu entfernen. Seien Sie äußerst vorsichtig, um das Gehirn nicht zu schädigen.

In diesem Experiment wird ein zuvor beschriebenes enzymbasiertes Mikroelektrodenarray verwendet, das mit Glutamatoxidase vorbeschichtet und mit MPD galvanisiert ist. Die Mikroelektroden-Arrays haben einen 40 Millimeter dicken, starren Schaft, der speziell für den Einsatz bei Ferkeln entwickelt wurde. Befestigen Sie den Metallarm am Mikromanipulator und positionieren Sie dann das Mikroelektrodenarray so vertikal wie möglich über dem Bregma.

Senken Sie dann das Array vorsichtig so tief wie möglich ab, ohne die Oberfläche des Schädels zu berühren, und notieren Sie sich die Koordinaten des Bregmas. Verwenden Sie nun einen Ferkelhirnatlas, um die genauen stereotaktischen Koordinaten der interessierenden Struktur zu bestimmen. Positionieren Sie dann die Mikroelektrode entsprechend.

Platzieren Sie anschließend die Pseudo-Referenzelektrode unter der Kopfhaut und stellen Sie den Kontakt mit dem Tier sicher. Senken Sie nun das Mikroelektrodenarray langsam auf nahezu die entsprechende Tiefe in das Gehirn ab. Verwenden Sie für die letzten 2 Millimeter einen hydraulischen Mikroantrieb, um das Array mit minimalem Gewebetrauma sanft in die gewünschte Struktur abzusenken.

Warten Sie nach dem Positionieren des Mikroelektrodenarrays 30 Minuten, damit die Elektroden den Ausgangswert erreichen können. Nehmen Sie dann etwa drei Stunden lang Messungen vor. Wenn das Ferkel den Versuch überleben soll, schließen Sie den Schnitt nach der Datenerfassung.