Induktion axonaler Varizen mit einem mikromechanischen Stimulus auf Neuronen

Beginnen Sie damit, eine Mikropipette mit angeschlossenem Schlauch an einem Mikromanipulator zu befestigen.

Befestigen Sie das andere Ende des Schlauchs über einen Anschluss mit drehbarem Ventil an einer mit einem Salzpuffer gefüllten Spritze.

Stellen Sie die Spritze in einer Höhe ein, die genügend Druck ausübt, um Krampfadern in den Axonen auszulösen.

Axonale Varizen sind perlenartige Schwellungen, die entlang der Länge eines Axons auftreten.

Positionieren Sie die Mikropipette im gewünschten Winkel relativ zur Kulturschale.

Verwenden Sie das Fluoreszenzlicht des Mikroskops, um die Spitze der Mikropipette auszurichten und sie in der Nähe der Oberfläche der Zellkulturschale mit Salzpuffer abzusenken.

Schalten Sie nun das Durchlicht ein und schalten Sie den Leuchtstofffilter aus.

Lege ein Deckglas mit Neuronen auf die Schale.

Fokussieren Sie sich zunächst auf die Mikropipette und passen Sie ihre Position an.

Konzentrieren Sie sich dann auf die Region, in der sich die Zielneuronen befinden.

Öffnen Sie das Ventil, um den Flüssigkeitsdruck aufrechtzuerhalten. Dieser mikromechanische Reiz induziert Krampfadern in diesen Neuronen.

Führen Sie bei diesem Verfahren die Pipette in den Schraubverschluss des Mikromanipulators ein, um sie an Ort und Stelle zu halten. Winkeln Sie die Pipette in einem 45-Grad-Winkel mit der Oberfläche zur Zellkulturschale an. Schalten Sie den Fluoreszenzfilter ein. Öffnen Sie die Blende und stellen Sie sicher, dass ein fluoreszierender Fleck durch das Objektiv fällt.

Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in eine Position, die die Spitze mit dem Fluoreszenzfleck ausrichtet, und senken Sie die Pipette in eine Position knapp über der Höhe der Zellkulturschale. Sobald es in Position ist, schalten Sie das Durchlicht ein und schalten Sie die Fluoreszenz aus. Übertragen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas mit den Zellen in Richtung Pipette von der Zellkulturplatte in die Zellkulturschale mit 2 Millilitern Hank-Puffer bei Raumtemperatur.

Fokussieren Sie mit dem Feinfokusknopf und dem 20-fach-Objektiv auf eine Ebene, die sich etwa vier volle Umdrehungen über den Zellen befindet. Positionieren Sie anschließend die Pipettenspitze mit dem Mikromanipulator so, dass sie fokussiert ist und sich in der linken Mitte der Ebene befindet, wie sie durch die Okulare gesehen wird. Sobald die Pipette in Position ist, fokussieren Sie das Mikroskop auf eine Ebene, die den interessierenden Bereich enthält.

In der Bildgebung von 7DIV zeigten GFP-transfizierte Maus-Hippocampus-Neuronen ein Axon vor und nach dem Aufblasen.