Elektrophysiologische Aufzeichnung der Spannungsantworten von retinalen Photorezeptoren der Drosophila auf Lichtreize

Montieren Sie eine Drosophila-Fliege mit freiliegendem Kopf auf eine Halterung.

Schaffen Sie eine Öffnung in einem Auge und entfernen Sie die Hornhaut, um die Netzhaut freizulegen.

Platzieren Sie die Halterung auf der Aufnahmeplattform.

Führen Sie eine stumpfe Referenzelektrode mit einer physiologischen Kochsalzlösung in die Kopfkapsel ein.

Führen Sie als nächstes eine scharfe Aufzeichnungselektrode mit einer intrazellulären Umgebungslösung durch die Öffnung in die Netzhaut ein.

Lassen Sie das Auge sich an die Dunkelheit anpassen.

Messen Sie den Widerstand der Aufnahmeelektrode, um sicherzustellen, dass sie für die Aufnahme geeignet ist.

Beseitigen Sie dann die Basisspannungsdifferenz zwischen der Aufzeichnungs- und der Referenzelektrode.

Während der Dunkeladaption bleiben spezifische Ionenkanäle in den retinalen Photorezeptorzellen offen, was einen stetigen positiven Ioneneinstrom ermöglicht.

Stimulieren Sie das Auge mit Lichtblitzen.

Als Reaktion darauf schließen sich die Ionenkanäle, wodurch der positive Ioneneinstrom reduziert und der Ausfluss gefördert wird.

Infolgedessen wird das Membranpotential der Photorezeptoren negativer, was von der Aufzeichnungselektrode als Einbruch der Spannung gemessen wird.

Wenn Sie den Mikroelektrodenverstärker betreiben, sollten Sie immer durch Berühren der Metalloberfläche des Faradayschen Käfigs oder des Antivibrationstisches geerdet werden, um statische Aufladungen zu vermeiden. Befestigen Sie die montierte Fliege an der Stange der Fliegenvorbereitungsplattform.

Drehen Sie den Fliegenhalter so, dass das linke Auge der Fliege direkt zum Untersucher zeigt. Führen Sie anschließend mit einem kleinen, groben Mikromanipulator die stumpfe Referenzelektrode vorsichtig durch die Augenflecken der Fliege in die Kopfkapsel ein. Stellen Sie sicher, dass die Fliege noch gesund aussieht und ihre Antennen bewegt. Die Vorbereitung muss hervorragend sein, um eine Aufnahme zu verdienen.

Treiben Sie nun die scharfe Aufzeichnungsmikroelektrode durch die mit Gelee beschichtete Öffnung in das linke Auge. Beim Eintritt in das Gewebe sollte die Position der Elektrodenspitze durch ihr Reflexionsmuster erkennbar sein. Die zerbrechliche Elektrodenspitze muss perfekt geführt werden, sonst bricht sie, was eine große Herausforderung darstellt.

Je nachdem, aus welchem Zelltyp aufgezeichnet wird, sollte der Kopf der Fliege etwas anders ausgerichtet sein. Schalten Sie den Mikroelektrodenverstärker ein, wenn die Elektroden an Ort und Stelle sind. Schalten Sie dann die Kaltlichtquelle aus, ziehen Sie den Netzstecker aus dem Stromnetz und schließen Sie sie an die zentrale Erdung an, um durch Erdschleifen verursachtes elektrisches Rauschen zu minimieren.

Stellen Sie anschließend die Schwanenhals-Lichtleiter so ein, dass das Kardanarmsystem frei um die Außenbahn bewegt werden kann. Schalten Sie dann das Raumlicht aus, um die Fliegenvorbereitung in relative Dunkelheit zu bringen. Messen Sie nun den Widerstand der Aufzeichnungselektrode im Auge. Er muss zwischen 100 und 250 Megaohm liegen.

Stellen Sie als Nächstes den Verstärker auf Stromzange oder -brücke ein und setzen Sie die Spannung zwischen den Elektroden auf Null. Nachdem die Fliege einige Minuten lang dunkeladaptiert wurde, treiben Sie die Spitze der Aufnahmeelektrode in Schritten von 0,1 bis 1 Mikrometer mit einem Piezo-Stepper oder durch sanftes Drehen des feinauflösenden Knopfes in das Auge.

Stimulieren Sie das Auge bei jedem Schritt mit einem Lichtblitz von 1 bis 10 Millisekunden. Jedes leichte Aufblitzen verursacht einen kurzen Einbruch der Spannung oder des ERG.