Überwachung der elektrischen Signale der afferenten Neuronen in einer immobilisierten Zebrafischlarve

Beginnen Sie mit einer immobilisierten, gelähmten Zebrafischlarve in einer Aufzeichnungskammer, die mit einer extrazellulären Lösung in einem elektrophysiologischen Aufbau gefüllt ist.

Füllen Sie eine afferente Mikropipette mit der extrazellulären Lösung, die Ionen enthält, die die elektrische Leitfähigkeit für die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität bieten.

Bauen Sie es zu einem Mikromanipulator zusammen, der eine Aufnahmeelektrode enthält, die mit einem Verstärker zur Signalaufzeichnung verbunden ist.

Üben Sie positiven Luftdruck aus, um ein Verstopfen der Pipette zu verhindern.

Bewegen Sie die Pipettenspitze entlang des Nervus der Seitenlinie und positionieren Sie sie neben dem afferenten Ganglion, das eine Ansammlung afferenter neuronaler Zellkörper enthält.

Die zellulären Prozesse dieser Neuronen sind mit den Haarzellen entlang der Seitenlinie verbunden, die Wasserbewegungen wahrnehmen.

Üben Sie dann einen sanften Unterdruck aus, um eine lose Dichtung zwischen der Mikropipette und dem afferenten Ganglion zu bilden.

Zeichnen Sie die elektrischen Signale der afferenten Neuronen auf, die den sensorischen Input von den Haarzellen in der immobilisierten Larve empfangen.

Immobilisieren Sie Zebrafischlarven und übertragen Sie sie mit einer Transferpipette mit großer Spitze in eine 35-Millimeter-Petrischale. Entfernen Sie so viel wie möglich von der umgebenden Lösung. Tauchen Sie die Larven etwa fünf Minuten lang in 10 Mikroliter 0,1 % Alpha-Bungarotoxin. Waschen Sie die gelähmte Larve 10 Minuten lang mit extrazellulärer Lösung. Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die Larve aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Aufzeichnungsschale mit Silikonboden zu bewegen.

Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinen Pinzette über der Mitte der Silikonmatte, mit der seitlichen Seite nach oben, wobei die vorderen und hinteren Enden des Körpers von links nach rechts verlaufen. Führen Sie den geätzten Stift mit einer Pinzette mit feiner Spitze orthogonal zum Silikon durch das dorsale Notochord der Larven direkt dorsal zum Anus ein. Führe den zweiten Stift durch die Chorda in der Nähe des Schwanzendes und führe den dritten Stift durch die Chord-Rückseite der Gasblase ein. Führen Sie den vierten Stift durch das otische Vesikel ein, während Sie ihn leicht drehen, während der Stift in das Verkapselungsmittel einführt.

Achten Sie bei einer leichten Drehung auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem otischen Vesikel, um den Cluster afferenter Somaten freizulegen. Platzieren Sie die fixierte Lava unter dem 10-fach-Objektiv auf einem festen Tisch des DIC-Mikroskops und richten Sie die myoseptalen Spalten der Muskelblöcke parallel zum linken Kopftischvektor aus.

Legen Sie das Erdungskabel in die Badlösung und stellen Sie sicher, dass es mit dem linken Kopftisch verbunden ist. Füllen Sie die afferente Aufnahmeelektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung und setzen Sie sie in den Pipettenhalter des rechten Kopftisches ein. Senken Sie es dann in die Schalenlösung ab, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Wandler erzeugt wird.

Lokalisieren Sie die Elektrode und führen Sie die Elektrodenspitze über die Probe. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferente Elektrodenspitze ab, bis sie sich über dem Cleithrum befindet. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache der Immersion und lokalisieren Sie den Schnittpunkt zwischen dem Nervus der hinteren Seitenlinie und dem Cleithrum. Führe die Elektrodenspitze über das afferente Ganglion und senke die Pipette ab, bis die Spitze das Epithel berührt. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das afferente Ganglion berührt.