JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:05 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein immobilisiertes transfiziertes Maushirnschnitt in einer elektrophysiologischen Aufzeichnungskammer, die mit sauerstoffreichem aCSF durchblutet ist.
Diese Scheibe enthält die Axonenden der Thalamusneuronen, die lichtempfindliche Ionenkanäle exprimieren, die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert sind.
Visualisieren Sie die fluoreszierenden Axone des Thalamusneurons und wählen Sie ein pyramidales Neuron aus.
Eine Aufzeichnungspipette, die eine Elektrode in einer intrazellulären Lösung enthält, wird mit leichtem Überdruck in Richtung des ausgewählten Neurons vorgeschoben.
Durch den Überdruck entsteht bei Kontakt ein Grübchen auf der neuronalen Membran.
Lassen Sie den Druck ab, um eine hochfeste Dichtung zu bilden.
Stellen Sie das Membranpotential auf einen konstanten negativen Wert ein.
Wenden Sie einen Unterdruckimpuls an, um die Membran zu durchbrechen und eine Ganzzellenkonfiguration zu erreichen.
Beleuchten Sie die Axonendigungen, aktivieren Sie die lichtempfindlichen Kanäle und depolarisieren Sie die neuronalen Membranen, wodurch Aktionspotentiale ausgelöst werden.
Exzitatorische Neurotransmitter werden freigesetzt und binden an Rezeptoren auf dem aufgezeichneten Neuron, was zu einem Kationeneinstrom führt.
Zeichnen Sie die resultierenden exzitatorischen postsynaptischen Ströme auf, was auf eine direkte synaptische Verbindung zwischen den Neuronen hinweist.
Um eine Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung durchzuführen, übertragen Sie vorsichtig ein Gehirnschnitt, der den Hippocampus-Komplex enthält, in die Aufnahmekammer. Perfundieren Sie die Aufnahmekammer kontinuierlich mit 34 Grad Celsius ACSF, das mit Carbogen bei 2 bis 3 Millilitern pro Minute blasiert ist. Untersuchen Sie kurz die Chronos-GFP-Expression in den Axonendigungen im interessierenden Bereich mit blauer LED-Beleuchtung bei 4-facher Vergrößerung.
Wechseln Sie zu einem 63-fach-Immersionsobjektiv und stellen Sie den Fokus ein. Suchen Sie nach Axonen, die Chronos GFP exprimieren, und wählen Sie ein pyramidales Neuron für die Patch-Aufzeichnung. Füllen Sie anschließend eine Pipette mit einer internen Lösung auf Kaliumgluconatbasis. Montieren Sie es in der Pipettenhalterung am Kopftisch. Patchen Sie die Zelle in der Spannungsklemmenkonfiguration.
Nähern Sie sich dem identifizierten Neuron und drücken Sie die Pipettenspitze vorsichtig auf das Soma. Durch den Überdruck sollte ein Grübchen auf der Membranoberfläche entstehen. Lassen Sie dann den Druck ab, um eine Giga-Ohm-Dichtung zu erzeugen. Stellen Sie nach dem Verschließen die Haltespannung auf minus 65 Millivolt ein.
Brechen Sie die Membran mit einem scharfen Unterdruckimpuls auf. Zeichnen Sie postsynaptische Reaktionen auf 475 Nanometer LED-Ganzfeldstimulation von afferenten Fasern, die Chronos exprimieren, in der Strom- oder Spannungsklemme auf. Stimulieren Sie mit Zügen von 10 Stimulationen von 2 Millisekunden Dauer bei 20 Hertz.