MicroRNA-vermittelte Hemmung exzitatorischer postsynaptischer Ströme in Hippocampusschnitten der Maus

Nehmen Sie Hippocampus-Hirnschnitte der Maus, die CA3-Neuronen enthalten, die mit einem rekombinanten viralen Vektor infiziert sind.

Das virale Genom exprimiert einen lichtaktivierten Kanal, der mit einem fluoreszierenden Reporter und einer microRNA markiert ist, die die Expression von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen herunterreguliert

Platzieren Sie ein Slice unter dunklen Bedingungen in einer Aufnahmekammer. Identifizieren Sie mit einem Mikroskop die fluoreszierenden CA3-Neuronen.

Platzieren Sie eine Aufzeichnungselektrode auf einem CA1-Neuron, das Eingaben von infizierten CA3-Neuronen empfängt. Brechen Sie die Membran, um intrazelluläre Ionenströme aufzuzeichnen.

Wenden Sie einen Inhibitor an, um inhibitorische Neurotransmitterrezeptoren zu blockieren, so dass nur erregende Signale gesendet werden können.

Stimulieren Sie mit Lichtimpulsen die lichtaktivierten Kanäle in den infizierten CA3-Neuronen und erzeugen so Aktionspotentiale.

Bei nicht infizierten Mäusen aktiviert das Aktionspotential spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, was zu einem Kalziumioneneinstrom führt, der die Freisetzung von Neurotransmittern auslöst. Die Neurotransmitter lösen exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) in den CA1-Neuronen aus.

Bei infizierten Mäusen führt die microRNA-vermittelte Reduktion der spannungsgesteuerten Kalziumkanäle zu einer EPSC-Hemmung.

Verwenden Sie für dieses Protokoll ein Tier, dem 15 Tage zuvor oder länger rAAV1/2 in das Gehirn injiziert wurde, gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll von Cetin und Co. Isolieren Sie das Gehirn und machen Sie akute Hirnschnitte mit einem Vibratom und gasförmigem eiskaltem aCSF.

Sammeln Sie die Scheiben der interessierenden Region und minimieren Sie deren Lichteinwirkung, um eine Aktivierung der optogenetischen Sonde zu vermeiden. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im selben aCSF ziehen. Verwenden Sie eine Kammer, die speziell für die Aufnahme von Hirnschnitten entwickelt wurde. Stellen Sie die Scheiben dann wieder auf Raumtemperatur her, wo sie sechs bis acht Stunden lang gesund bleiben.

Um fortzufahren, übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer und fusionieren Sie sie mit zwei Millilitern pro Minute aCSF. Überprüfen Sie anschließend kurz das Signal des exprimierten fluoreszierenden Reporters, um die Lokalisation und Intensität der Infektion zu ermitteln. Füllen Sie dann eine Patch-Elektrode mit der intrazellulären Lösung.

Erhalten Sie nun unter Infrarotbeleuchtung eine dicht schließende Ganzzellkonfiguration auf einem Neuron, das synaptische Eingaben von den infizierten Neuronen empfängt. Der Serienwiderstand kann nicht kompensiert werden, sollte aber konstant und gering sein. Wenn beispielsweise CA3-Pyramidenneuronen infiziert wurden, patchen Sie die Pyramidenneuronen im proximalen bis medialen Trakt der CA1-Region.

Wenn die Zellen geschrumpft oder geschwollen aussehen, wenn das Patchen schwierig wird oder die Patches instabil sind, sind die ausgewählten Schichten nicht lang genug, um von ihnen aufzunehmen.

Verwenden Sie als Nächstes die Pharmakologie, um die zu untersuchenden synaptischen Ströme zu isolieren. Wenn das Ziel beispielsweise darin besteht, die exzitatorische synaptische Übertragung zu untersuchen, blockieren Sie die inhibitorische synaptische Übertragung, indem Sie Bicucullin in das Bad geben.

Evozieren Sie dann synaptische Ströme wie exzitatorische postsynaptische Ströme mit einem blauen Laser mit einem 473 Nanometer großen Laser, der an eine optische Faser gekoppelt ist, die an den Spaltöffnungen der infizierten Neuronen positioniert ist. Richten Sie den Laser nicht auf die Axone des Neurons.

Vermeiden Sie es beispielsweise, die Schaffer-Sicherheiten zu beleuchten. Eine direkte Depolarisation der Axone ist nicht erwünscht. Passen Sie dann die Stimulationslänge auf ein Minimum an, um die Möglichkeit zu verringern, mehr als ein Aktionspotential pro Lichtimpuls hervorzurufen.

Verfeinern Sie als Nächstes die Intensität des Lasers, um einen kleinen, aber deutlich nachweisbaren synaptischen Strom hervorzurufen. Passen Sie beispielsweise für die exzitatorische synaptische Übertragung zwischen CA3- und CA1-Pyramidenneuronen die Intensität des Lasers so an, dass synaptische Ströme von 20 bis 50 Pikoampere hervorgerufen werden.