Aufzeichnung synaptischer Ströme an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve

Stellen Sie eine Petrischale mit einer sezierten Drosophila-Larve mit freiliegenden Muskeln und Nervenästen auf den Mikroskoptisch.

Führen Sie eine Referenzelektrode in eine Badlösung in der Petrischale ein.

Füllen Sie eine Aufzeichnungselektrode mit einer isotonischen Lösung.

Positionieren Sie diese Elektrode mit einem Mikromanipulator über einem Bauchmuskel, der von Motoneuronen innerviert wird.

Platzieren Sie die Elektrodenspitze auf einem synaptischen Bouton, einer Struktur an der Axonspitze, die Neurotransmitter enthält.

Kontinuierliche Aufzeichnung von miniaturisierten exzitatorischen Verbindungsströmen oder mEJCs, die Reaktionen auf die spontane Freisetzung von Neurotransmittern sind.

Der korrekte Bereich der mEJC-Amplitude bestätigt die korrekte Positionierung der Elektrode.

Positionieren Sie als Nächstes eine Stimulationselektrode in der Nähe des Axons, das den Zielmuskel innerviert.

Üben Sie Unterdruck aus, um das Axon in die Elektrode zu ziehen.

Erhöhen Sie allmählich den Reizstrom, um ein Aktionspotential zu induzieren.

Dies veranlasst das Axon, Neurotransmitter an der neuromuskulären Verbindung freizusetzen, die als synaptische Ströme aufgezeichnet werden.

Stellen Sie die Petrischale mit dem Präparat auf den Mikroskoptisch. Führen Sie die Referenzelektrode in das Bad ein. Füllen Sie die Aufzeichnungselektrode mit HL3-Lösung. Tauchen Sie die Elektrode unter dem 10x-Objektiv in das Bad und platzieren Sie sie mit dem Mikromanipulator über den Muskeln sechs und sieben der Bauchsegmente 2, 3 oder 4.

Schalten Sie dann das Objektiv auf 60X und fokussieren Sie sich auf den interessierenden Bereich, indem Sie entweder Epi-Fluoreszenz- oder DIC-Optik verwenden. Platzieren Sie die Spitze der Elektrode auf den synaptischen Boutons und drücken Sie die Elektrode dann sehr vorsichtig auf den Muskel, da übermäßiger Druck den NMJ schädigen oder eine Zunahme der spontanen synaptischen Aktivität induzieren kann.

Schalten Sie als Nächstes den Verstärker, die AD-Platine und den Computer ein. Wählen Sie dann den Spannungsklemmmodus am Verstärker. Starten Sie die Erfassungssoftware, wählen Sie den lückenlosen Modus und beobachten Sie das Erscheinungsbild von mEJCs auf dem Computerbildschirm. Es ist darauf zu achten, dass die Amplitude der mEJCs im Bereich von 0,2 bis 0,7 Nanoampere liegt.

Platzieren Sie die Stimulationselektrode mit einem Mikromanipulator unter visueller Kontrolle in der Nähe des Axons, das die Bauchsegmente 2 bis 4 innerviert. Üben Sie Unterdruck aus, indem Sie den Kolben der Spritze, die mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, ziehen, so dass das Axon in die Elektrode hineingezogen wird.

Schalten Sie anschließend den Stimulator ein. Drehen Sie den Knopf an der Isolationseinheit, um einen Nullstrom einzustellen, und erhöhen Sie ihn dann vorsichtig, bis die EJCs erscheinen oder bis der Schwellenwert erreicht ist. Die Stimulation wird in einem Regime über dem Schwellenwert durchgeführt, wobei der Stimulationsstrom im Vergleich zum Schwellenwert für die Beobachtung von EJCs etwa doppelt so hoch ist.