Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität des neuronalen Netzwerks in einer Neuron-Astrozyten-Kokultur

Beginnen Sie mit einer MEA-Platte (Multi-Electrode Array). Jede Vertiefung enthält ein zentral positioniertes Array von Elektroden.

Das Array ist mit einem Kultursubstrat beschichtet, um die Zelladhäsion zu erleichtern.

Fügen Sie eine Suspension von Motoneuronen und Astrozyten als Tröpfchen über das Array hinzu.

Inkubieren, um die Zelladhäsion zu ermöglichen, und dann ein warmes Co-Kulturmedium hinzufügen, das mit einem kleinen Molekül ergänzt wird, das die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhält.

Während der Inkubation sezernieren Astrozyten Faktoren, die die neuronale Reifung und Synapsenbildung fördern, was zu einem neuronalen Netzwerk führt.

Platzieren Sie die MEA unter physiologischen Bedingungen in einem Aufzeichnungsgerät, um die neuronale Aktivität zu überwachen.

Neuronen übertragen elektrische Signale, sogenannte Aktionspotentiale, die sich entlang ihrer Axone bewegen.

Beim Erreichen der Synapse löst das Signal die Freisetzung von Neurotransmittern aus und leitet das Signal an das nächste Neuron weiter.

Elektroden in jeder Vertiefung zeichnen extrazellulär die Signale auf, die von synaptisch verbundenen Neuronen erzeugt werden.

Die Detektion synchronisierter rhythmisch-elektrischer Signale bestätigt den Aufbau eines neuronalen Netzwerks.

Beginnen Sie am Tag der Beschichtung oder davor mit der Beschichtung der 24-Well-MEA-Platten, indem Sie PLO zuerst in Wasser oder PBS verdünnen. Geben Sie dann 15 bis 20 Mikroliter PLO in jede Vertiefung und bilden Sie ein Tröpfchen in der Mitte der Vertiefung, das den Elektrodenbereich bedeckt und darauf achtet, dass die Elektroden mit der Pipettenspitze nicht beschädigt werden.

Geben Sie Wasser in die umgebenden Vertiefungen der Kammern, sorgen Sie für ausreichende Luftfeuchtigkeit, und inkubieren Sie PLO 1 bis 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie dann mit einer Mikropipettenspitze aus Kunststoff so viel PLO wie möglich ab, ohne die Elektroden zu berühren. Waschen Sie anschließend die Mulde dreimal mit 250 Mikrolitern Wasser.

Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze so viel Wasser wie möglich und lassen Sie die Oberfläche bei abgenommenem Deckel trocknen. Fügen Sie als Nächstes 15 bis 20 Mikroliter verdünntes Laminin hinzu, um jedes Elektrodenarray zu bedecken. Nachdem Sie Wasser in die Feuchtigkeitsfächer gegeben und den Deckel wieder aufgesetzt haben, inkubieren Sie mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius bis über Nacht.

Am Tag der Plattierung, nachdem Sie die Motoneuronen und Astrozytenkulturen einmal mit PBS gespült haben, fügen Sie 0,05% Trypsin hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für etwa 5 Minuten, um die Zellen anzuheben. Sammeln Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das den Trypsin-Inhibitor enthält, und waschen Sie die Platten mit Medium oder Boden, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden.

Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie dann mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette Motoneuronen und Astrozyten mit einem Co-Kulturmedium, das 20 Mikromolare ROCK-Inhibitor enthält, um 1 Milliliter einer Einzelzellsuspension zu erzeugen. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Motoneuronen und Astrozyten, verschließen Sie während der Zählung die Zellsuspensionen und legen Sie sie bei 4 Grad Celsius in ein Styroporgestell.

1 Milliliter beider Zellsuspensionen wird 5 Minuten lang bei 300-mal g zentrifugiert. Berechnen Sie das gewünschte Volumen und suspendieren Sie die Pellets erneut. Kombinieren Sie das erforderliche Volumen an Neuronen- und Astrozytensuspensionen in gleichen Verhältnissen und mischen Sie vorsichtig, indem Sie zweimal pipettieren, um gründlich zu kombinieren.

Entfernen Sie dann Laminin aus jeder Vertiefung der Platte und übertragen Sie 10 Mikroliter der endgültigen kombinierten Zellsuspension in jede Vertiefung, wodurch ein kleines Tröpfchen entsteht, das das Elektrodenarray bedeckt. Inkubieren Sie die Platten mit einem ungestörten Zelltröpfchen bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, um erste Anhaftungen auf den Platten zu bilden.

Pipettieren Sie dann 250 Mikroliter warmes Co-Kulturmedium mit ROCK-Inhibitor an die Wand jeder Vertiefung, pipettieren Sie das gleiche Volumen an der gegenüberliegenden Wand jeder Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 24 bis 36 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Platten am nächsten Tag auf Ablagerungen oder abgestorbene Zellen und tauschen Sie das Medium bei Bedarf gegen ein frisches Co-Kulturmedium aus, das den ROCK-Inhibitor enthält.

Andernfalls führen Sie ab Tag 2 der Co-Kultur zweimal pro Woche einen Austausch des halben Mediums mit einem Co-Kulturmedium ohne ROCK-Inhibitor durch. Um die Aufzeichnung durchzuführen, beginnen Sie so bald wie möglich nach der Co-Kultur Tag 1, indem Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und das Kohlendioxid auf 5 % einstellen. Übertragen Sie dann die Platten auf das Aufnahmegerät und äquilibrieren Sie sie mindestens fünf Minuten lang, bevor Sie aufnehmen. Zeichnen Sie die Ausgangsaktivität jeden zweiten Tag oder wöchentlich über 1 bis 15 Minuten auf, je nach Versuchsdesign.