Gleichzeitige Messung des intrazellulären Calcium- und Membranpotentials in einem zerebralen Endothel der Maus

Man nehme Segmente einer hinteren Hirnarterie der Maus.

Inkubieren Sie mit einer Enzymlösung, um die Gewebematrix abzubauen und die Zellen zu lockern.

Ersetzen Sie die Lösung durch einen Puffer und übertragen Sie dann ein Segment in eine Aufnahmekammer.

Dissoziieren Sie mechanisch die Zellschichten des Bindegewebes und der glatten Muskulatur und isolieren Sie die darunter liegende Endothelröhre.

Sichern Sie den Schlauch, entfernen Sie die dissoziierten Schichten und fügen Sie einen physiologischen Puffer hinzu.

Platzieren Sie die Kammer in einem Aufzeichnungssystem mit kontinuierlichem Pufferfluss.

Führen Sie einen fluoreszierenden Kalziumindikator ein, der in die Endothelzellen eindringt, und führen Sie dann eine Aufzeichnungselektrode in eine Zelle ein.

Verabreichen Sie ein Medikament, das den Einstrom von Kalziumionen auslöst und die nachgeschaltete Signalübertragung für die Kalziumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum induziert.

Der Indikator bindet an das Kalzium und emittiert bei Anregung Fluoreszenz.

Die Kalziumerhöhung aktiviert kalziumabhängige Kaliumkanäle, was zu einem Kaliumabfluss führt und das Membranpotential verändert.

Erfassen Sie gleichzeitig Veränderungen des intrazellulären Kalziums über das Fluoreszenzsignal und das Membranpotential mit der Elektrode.

Bereiten Sie bei diesem Verfahren die Verreibungsvorrichtung mit einem Mikroskop, einer Kamera und einem Aluminiumtisch vor, auf dem sich eine Kammer und Mikromanipulatoren befinden. Befestigen Sie eine Mikrospritze mit einer Pumpensteuerung neben dem Tisch und der Probe. Füllen Sie anschließend eine Verreibpipette vollständig mit Mineralöl auf und befestigen Sie sie über dem Kolben der Mikrospritze.

Entnehmen Sie dann mit der Mikrospritze mit Pumpensteuerung etwa 130 Nanoliter Dissoziationslösung in die Pipette und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Anschließend werden intakte arterielle Segmente in einen Milliliter Dissoziationslösung mit den erforderlichen Enzymkonzentrationen in ein 10-Milliliter-Glasröhrchen gegeben.

Inkubieren Sie bei 34 Grad Celsius für 10 bis 12 Minuten für einen teilweisen Aufschluss. Ersetzen Sie die Enzymlösung nach dem Aufschluss durch 5 Milliliter frische Dissoziationslösung. Übertragen Sie mit einer 1-Milliliter-Pipette ein Segment bei Raumtemperatur in die Kammer mit der Dissoziationslösung.

Legen Sie dann die Pipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßes. Stellen Sie an der Pumpensteuerung eine Rate im Bereich von 2 bis 5 Nanolitern pro Sekunde ein, um eine sanfte Verreibung zu erzielen. Während Sie durch eine 100- bis 200-fache Vergrößerung sehen, ziehen Sie das arterielle Segment zurück und ausstoßen Sie es, um glatte Muskelzellen zu dissoziieren und gleichzeitig eine Endothelröhre zu erzeugen.

Verwenden Sie bei Bedarf vorsichtig eine Pinzette mit feiner Spitze, um dissoziierte Adventitien und innere elastische Lamina von der Endothelröhre zu trennen. Vergewissern Sie sich, dass alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und dass nur die Endothelzellen als intakte Röhre verbleiben.

Befestigen Sie mit Hilfe von Mikromanipulatoren jedes Ende des Endothelrohrs mit Hilfe von Borosilikatglaspipetten auf dem Glasdeckglas der Superfusionskammer. Waschen Sie die dissoziierten Adventitia- und glatten Muskelzellen aus der Kammer aus und ersetzen Sie die Dissoziationslösung durch zwei millimolare Calciumchlorid-PSS.

Übertragen Sie die mobile Plattform, die an der Endothelröhre befestigt ist, auf das Mikroskop des Superfusions- und Experimentierpräparats. Verwenden Sie dann sechs saubere 50-Milliliter-Reservoirs für die kontinuierliche Abgabe von PSS und den entsprechenden Wirkstofflösungen während des Experiments.

Verwenden Sie das Inline-Durchflussregelventil, um die Durchflussrate manuell so konstant wie die laminare Strömung einzustellen und gleichzeitig die Durchflusszufuhr an die Vakuumabsaugung anzupassen. Geben Sie PSS für mindestens fünf Minuten in die Kammer für die Superfusion des Endothelröhrchens, bevor Sie die Hintergrunddaten und die Farbstoffbeladung aufzeichnen.

Um das Membranpotential gleichzeitig mit der intrazellulären Kalziumkonzentration zu messen, ziehen Sie an einer scharfen Elektrode und füllen Sie sie mit zwei molaren Kaliumchlorid auf, um von Zellen aufzuzeichnen, die mit Fura-2-Farbstoff beladen sind.

Um die interzelluläre Kopplung durch Farbstofftransfer zu untersuchen, füllen Sie die Mikroelektrode mit 0,1 % Propidiumiodid, gelöst in zwei molaren Kaliumchlorid, auf. Legen Sie dann die Elektrode über einen mit Chlorid beschichteten Silberdraht in den Pipettenhalter, der an einem Elektrometerkopftisch befestigt ist, der mit einem Mikromanipulator gesichert ist.

Positionieren Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Elektrode kurz in das strömende PSS in der Kammer, während Sie durch das vierfache Objektiv schauen. Stellen Sie anschließend das Ruhemembranpotential auf Null ein, wie es mit dem geerdeten Badpotenzial übereinstimmt.

Falls gewünscht, können Sie akustische Basismonitore verwenden, die mit Elektrometern verbunden sind, um die Tonhöhe mit potenziellen Aufnahmen zu verknüpfen. Erhöhen Sie anschließend die Vergrößerung auf das 400-fache mit einem 40-fachen Objektiv und positionieren Sie die Elektrodenspitze knapp über einer Zelle des Endothälhrchens.

Passen Sie das photometrische Fenster mit der Photometrie-Software an, um auf etwa 50 bis 80 Endothelzellen zu fokussieren. Platzieren Sie dann die Elektrode vorsichtig mit dem Mikromanipulator in eine der Zellen des Endothelrohrs und warten Sie mindestens zwei Minuten, bis sich das Ruhemembranpotential stabilisiert hat.

Sobald das ruhende Membranpotential stabil auf seinem erwarteten Wert ist, schalten Sie die Photomultiplierröhre an der Fluoreszenzgrenzfläche in Abwesenheit von Licht ein und beginnen Sie mit der Erfassung der intrazellulären Kalziumkonzentration, indem Sie Fura-2 abwechselnd bei 340 und 380 Nanometern anregen, während die Fluoreszenzemission bei 510 Nanometern gesammelt wird.

Sobald die gleichzeitigen Messungen des Membranpotentials und der intrazellulären Kalziumkonzentration etabliert sind, planen Sie etwa fünf Minuten für die Superfusion des Endothelrohrs mit PSS bei einer konstanten laminaren Flussrate ein, bevor Sie Medikamente applizieren.

Tragen Sie das in PSS vorbereitete Arzneimittel mit konstanter Durchflussrate in die Superfusionskammer auf. Messen Sie während der medikamentösen Behandlung gleichzeitig das Membranpotential im Verhältnis F340/F380. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, ziehen Sie die Elektrode aus der Zelle. Stoppen Sie dann die jeweiligen Aufzeichnungen des Membranpotentials und der intrazellulären Kalziumkonzentration und speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse.