Name: Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Erfahren Sie die In-vivo-Bildgebung von dorsalen Wurzelaxonen nach Rhizotomie bei thy1-YFP-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die wiederholte Beobachtung der Axonregeneration am Rückenmarkseintritt über mehrere Wochen.

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Wir danken Herrn Dr. Alan Tessler für Kommentare und Leitartikel zu helfen. Diese Arbeit wurde vom NIH NS062320 unterstützt.

1. Mikroskop aufgebaut und Imaging-Vorbereitung <ol><li> Unsere bildgebenden Einrichtung besteht aus einem Leica MZ16 fluoreszierenden Stereomikroskop mit einer schnellen Verschlusszeit und eine gekühlte CCD-Kamera von Metamorph-Software gesteuert. </li><li> Bereiten Sie einen thermostatisch geregelten Heizkissen und passen Ausgang bis 32,5 ° C zu halten das Tier seine Körpertemperatur während und nach der Operation. </li><li> Warm sterile Ringer-Lösung oder künstliche Liquor (ACSF) bis 32,5 ° C im Voraus für die Bewässerung des Rückenmarks während der Operation. </li><li> Anesthetize das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (120 mg / kg) Cocktail. </li><li> Shave den oberen Rücken mit kleinen Tierschermaschinen und verbreiten einen kleinen Tropfen der Haarentfernung Lotion über die rasierte Fläche mit Wattestäbchen Abstriche. Minuten später, entfernen Sie die Anwendung Lotion mit 70% igem Ethanol getränkten Gaze Schwämme. </li></ol> 2. Laminektomie und chirurgische Freilegung der L5 Spinalganglien <ol><li> Legen Sie das Tier auf einem beheizten (32,5 ° C) pad und desinfizieren die Haut mit 70% Ethanol getränkten Wattestäbchen. </li><li> Unter Hellfeldbeleuchtung auf dem Stereomikroskop, führen Sie einen Medianschnitt (2 - bis 3-cm) in der Haut des Rückens. Falls erforderlich, verwenden Wattestäbchen Abstriche, um die Blutung zu stoppen. </li><li> Spiegeln die Muskulatur der Wirbelsäule auf die zugrunde liegende Lendenwirbel aussetzen. </li><li> Setzen Sie die L3-S1 Wirbelsäulensegmente durch rechtsseitige Hemi-Laminektomie mit kleinen Rongeure. Eine partielle Laminektomie auszusetzen 4-6 Segmenten der Lenden-und sakralen Rückenmark wird durch Entfernen der rechten dorsalen Teil des L5 Wirbel auf der Ebene der dem Beckenkamm des Hüftgelenkes (Standort der L5 DRG) rostral der L2 Wirbel (2 erstellt Wirbel kaudal der letzten Rippe). Perfundieren den Hohlraum mit warmen sterile Ringer-Lösung. </li><li> Position des Tieres auf einem Stützkissen (gerollt Baumwollgaze), um die Wirbelsäule zu glätten. Verwenden Sie Einfahren Haken auf den Bereich zu erweitern. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt (ca. 30 Minuten nach dem ersten ip Injektion von Anästhetika, eine Ergänzung (0.5X) subkutan injiziert werden, um zu halten das Tier vollständig betäubt. Alternativ-, Gas-Anästhesie (2-4% Isofluran in 0.5L/min Sauerstoff ) kann bei wiederholter Betäubung während der Bildgebung, die länger als 1 Stunde genutzt werden. </li></ol> 3. Rhizotomie / Spinalganglien crush <ol><li> Wechseln Sie zu Fluoreszenzanregung zu visualisieren YFP markierten (+) Axone. </li><li> Mit der Spitze eines Sub-Q (26ga.) Nadel, führen Sie einen kleinen Einschnitt in die Dura über der L5 Spinalganglien (DR). Perfundieren wiederholt mit Ringer-Lösung und reinigen Sie vorsichtig mit Wattestäbchen Abstriche. </li><li> Identifizieren Sie die Website zu zerschlagen werden und legen Sie eine Seite einer feinen Pinzette (Dumont Nr. 5) subdural. </li><li> Schließen Sie die Zange vorsichtig, aber fest und hält den medialen Teil des L5-Wurzel für 10 Sekunden, und dann sanft Release der Zange. </li><li> Wash wiederholt mit physiologischer Kochsalzlösung und sauber vorsichtig mit Wattestäbchen Abstriche. </li></ol> 4. Bildaufnahme und post-op Verfahren <ol><li> Erhalten Sie mehrere Bilder der gesamten exponierten Bereich einschließlich der Andrang vor Ort und die Drez vor und direkt nach der Andrang bei niedrigen und hohen Vergrößerungen. </li><li> Die Bilder werden entweder als einzelne Schnappschüsse oder als mehrere Streams von 10 bis 20 Frames innerhalb von 30 Unternehmen erworben - bis 40-ms Belichtungszeit. In-Fokus-Bilder werden dann ausgewählt und einen Überblick montage entsteht später mit Photoshop. </li><li> Zur Minimierung der Narbenbildung, dicht gelten ein Stück dünnen synthetischen Matrix-Membran (Biobrane), gefolgt von künstlichen dura gefolgt, auf der exponierten Rückenmark. Achten Sie darauf, Stücke geschnitten passgenau in die freigelegte Rückenmark Fenster, so dass sie Anhänger des Rückenmarks sind. </li><li> Schließen Sie die Muskulatur mit sterilem Nahtmaterial 5-0 und in der Nähe der Mittellinie Schnitt mit Wundklammern. </li><li> Inject Ringer-Lösung (0,3-bis 0,5-ml subkutan), und zu verwalten, Buprenorphin als postoperative Analgesie (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 h für 2 Tage. </li><li> Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen (34 ° -35 ° C) bis erholt. </li></ol> 5. Wiederholte Bildgebung <ol><li> Anesthetize das Tier, und entfernen Sie die Wunde Clips und Nähte. </li><li> Entfernen künstliche Dura und dünne synthetische Matrix Membranflecken und halten sie in einem sterilen Röhrchen mit Ringer-Lösung für die spätere Wiederverwendung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die kumulierte Bindegewebe Narbe mit der gebogenen Spitze eines Sub-Q Nadel und feinen Pinzette. Perfundieren häufig mit warmen Ringer-Lösung. </li><li> Re-Setzen der operative Bereich, einschließlich crush Website und Drez, verlagern YFP + Axone in früheren Sitzungen abgebildet, und wiederholen Sie die in Abschnitt 4 beschrieben. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir haben beobachtet, dass, während sie nicht nach einer Durchtrennung Verletzungen regenerieren sich, fast alle YFP + Axone über die Website von wuchsenVerletzungen von 3 Tagen nach crush (Abbildung 1) 11. In der Regel am nächsten Tag nach crush, beobachteten wir sterben-zurück-Degeneration proximalen Stumpf Axonen und Fragmentierung / Degeneration der Axone gleichen distal der zerquetschen, was bedeutet, dass Axone war entsprechend beschädigt bestätigt (z. B. Abbildung 1; Tag 3 und 5) . Mehrere zusätzliche Kriterien angewendet werden, um eindeutig zu unterscheiden regenerierenden Axone von Axonen, die verschont wurden oder hatte von der Verletzung erholt. Dazu gehörten die folgenden: (1) regenerierenden Axone zeigen eine Erweiterung der nicht-fluoreszierenden Teil des YFP + Axon das Gedränge vor Ort durch proximale und distale Degeneration (im Gegensatz zu einer Verengung der unmarkierten Lücke durch fluoreszierende Zytoplasma Nachfüllen der Andrang vor Ort Wenn Axone überlebte die Verletzung), (2) regenerierenden Axonen sind viel dünner, weniger hell fluoreszierendes und mehr welligen als Axone, dass die Verletzung überlebt, (3) Regeneration Neuriten sind dünner und schwach fluoreszierenden als die degenerierenden fluoreszierenden Fragmente der Axone durch die sie verlängert, (4) im Gegensatz zu überleben oder Axonen verschont, regenerierenden Axonen an der Drez stoppen, und (5) im Gegensatz zu überleben oder Axonen verschont, regenerierenden Axonen zeigen keine Knoten Ranvier. Abbildung 1 zeigt vier oberflächlichen YFP + Axone unmittelbar nach crush (A1; farbige Pfeile). Drei Tage nach dem Gedränge, erweitern alle vier Axone einem Neuriten, dass durch das Gedränge vor Ort (A2) wächst. Fünf Tage nach crush, bleiben Neuriten stabil und es gibt keine zusätzlichen Wachstum von diesen oder anderen proximalen Axone (A3). Die Regeneration von Neuriten, dass das Gedränge vor Ort durch viel dicker und heller fluoreszierende Fragmente eines degenerierenden Axon (dh endoneuralen Rohre) längliche gekreuzt, und kommen zu dem Drez bereits 4 Tage nach der Andrang (ca. 3mm / 2 Tage) 11. Wiederholte Bildgebung dieser Axone und ihre Spitzen alle zwei oder drei Tage für zwei weitere Wochen (Abbildung 2) ergab, dass sie nicht nach vorne wachsen oder zurückzunehmen, blieb aber unbeweglich. Die einzige merkliche Veränderung wurde von den Spitzen und Wellen von einigen Axonen Schwellung. Diese Beobachtungen zeigen somit überraschend schnell und chronische Immobilisation der regenerierenden Axone bei der Drez. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Wiederholte Bildgebung von L5 DR YFP + Axone an der Stelle der Spinalganglien crush über 5 Tage. Der mediale Teil der L5-Wurzel war am Boden zerstört (rot Pfeilspitze) und abgebildet an den Tagen 0, 3 und 5 nach dem Gedränge. Der Bereich der Andrang ist in der rechten Panels (A1-A3) vergrößert. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2:. Wiederholte Bildgebung von Axonen kam zu dem Drez über 20 Tage nach L5-Wurzel crush Tag 4, drei Axone (farbige Pfeile) kam zu dem Drez. Die Spitzen dieser Axone bleiben in der gleichen Lage und haben ein ähnliches Aussehen in aufeinander folgenden Sitzungen an den Tagen 7, 9, 13, 15 und 20. Die Positionen der ein Axon Spitze im Vergleich zu anderen Axon Tipps und Sehenswürdigkeiten (Sternchen) wurden verwendet, um Axon Motilität zwischen Imaging-Sessions zu bestimmen.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li>
<li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li>
<li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia%2C+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li>
<li>Maio, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration%3A+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS%2FPNS+border%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Imaging DR Regeneration direkt in lebenden Mäusen ist eine besondere Herausforderung, weil es eine erhebliche dorsale Laminektomie benötigt, um Axon-Wachstum über einen weiten Bereich von mehreren invasive chirurgische und Anästhesieverfahren in aufeinander folgenden Sitzungen folgten überwachen. Mehrere Strategien dazu beigetragen, diese Herausforderungen zu meistern. Erste erfolgreiche Bildgebung erforderlich Reduzierung Maus Mortalität (ca. 25%) durch die Minimierung der Dauer der Narkose und Blutungen, und durch sor...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> H-Linie THY1-YFP (2-4 Monate alt, beiderlei Geschlechts) </td><td> Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin (AnaSed Injektion, sterile Lösung) </td><td> Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kg </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketamin-Hydrochlorid Injektion, USP) </td><td> Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kg </td></tr><tr><td> Buprenorphin (Buprenex injizierbare) (0,05 mg / kg) </td><td> Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> Kleintier-Haarschneidemaschinen </td><td> Oster Professional, (McMinnville, TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> Haarentfernung Lotion </td><td> Church &amp; Dwight Co. (Princeton, NJ) </td><td> NAIR mit Baby-Öl </td><td></td></tr><tr><td> Gazetupfer </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen Abstriche </td><td> Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) </td><td> 14 bis 960-3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml-Spritzen </td><td> Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Subkutane (Sub-Q) Nadeln, 26ga. </td><td> Becton, Dickinson und Company (Franklin Lakes, NJ) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> Frühling Schere und Pinzette </td><td> Feine Science Tools, (Foster City, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,5-mm gebogene Rongeure </td><td> Feine Science Tools, (Foster City, CA) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Injection USP </td><td> B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) </td><td> BBR-L7502 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Kochsalzlösung </td><td> APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> Thin synthetischen Matrix-Membran (Biobrane) </td><td> Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> Künstliche dura </td><td> Gore Rückweisungen MVP Dura Substitute, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 Seidenfäden </td><td> Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) </td><td> K-580 </td><td></td></tr><tr><td> Wound-Clips </td><td> Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, Frankreich) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Stereomikroskop </td><td> Leica Microsystems (Wetzlar, Deutschland) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu (Bridgewater, NJ) </td><td> ORCA-Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> World Precision Instruments (Sarasota, FL) </td><td> ATC 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph-Software </td><td> Molecular Devices (Sunnyvale, CA) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Photoshop </td><td> Adobe Systems, San Jose, CA </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging von spinalganglien axone nach rhizotomie

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Die primären sensorischen Axone durch spinale Verletzungen verletzt ausfallen, um in das Rückenmark zu regenerieren, was zu chronischen Schmerzen und dauerhaften Verlust der Empfindung. Regeneration der Spinalganglien (DR) Axone in das Rückenmark an der Spinalganglien Eingangszone (Drez), die Schnittstelle zwischen dem ZNS und PNS verhindert. Unser Verständnis der molekularen und zellulären Vorgänge Regeneration bei Drez zu verhindern, ist unvollständig, zum Teil, weil komplexe Änderungen mit Nervenverletzung verbunden von postmortalen Analysen abgeleitet worden sind. Dynamische zelluläre Prozesse, wie Axonregeneration, werden am besten mit Techniken, die Echtzeit-Ereignisse mit mehreren Beobachtungen von jedem lebenden Tier einzufangen untersucht. Unsere Fähigkeit, Neuronen seriell in vivo-Monitor hat dramatisch zugenommen aufgrund revolutionäre Innovationen in der Optik-und Maus-Transgenen. Mehrere Linien der THY1-GFP transgenen Mäusen, bei denen Teilmengen von Neuronen genetisch in unterschiedlichen fluoreszierenden Farben markiert, ermöglichen individuelle Neuronen in vivo 1 abgebildet werden. Diese Mäuse wurden umfassend in-vivo-Bildgebung von Muskel 2-4 und 5-7 Gehirn verwendet, und sofern neue Einblicke in physiologische Mechanismen, die statischen Analysen nicht gelöst haben könnte. Imaging-Studien von Neuronen im Rückenmark leben erst seit kurzem. Lichtman und seine Kollegen demonstrierten ihre Realisierbarkeit durch die Verfolgung verletzt dorsalen Spalte (DC) Axone mit Weitfeldmikroskopie 8,9. Multi-Photonen-in-vivo-Bildgebung von tief positioniert DC Axone hat Mikroglia und Blutgefäße, auch schon 10 erreicht. In den letzten Jahren haben wir bei der Anwendung in-vivo-Bildgebung, um die Regeneration von Axonen DR mit Weitwinkel-Mikroskopie und H-Linie von THY1-YFP Mäusen Monitor Pionierarbeit. Diese Studien haben wir eine neuartige Hypothese darüber, warum DR Axone sind aus nachwachsenden innerhalb des Rückenmarks 11 verhindert geführt. In H-Linie von THY1-YFP Mäusen unterscheiden YFP + Axone oberflächlich positioniert, die ermöglicht, dass mehrere Axone gleichzeitig überwacht werden. Wir haben gelernt, dass DR Axone Ankunft am Drez besser in Lendenwirbelsäule als im zervikalen Rückenmarks abgebildet. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir verschiedene Strategien, die wir als nützlich erwiesen, um langfristig erfolgreich und wiederholte Bildgebung zu regenerieren DR Axone zu gewährleisten haben. Dazu gehören Methoden, die wiederholt Intubation und Atemwege Unterbrechung zu beseitigen, zu minimieren Chirurgie-assoziierten Stress und Narbenbildung, und erwerben stabile Bilder mit hoher Auflösung ohne Phototoxizität.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Bildgebungsprotokoll zu primären sensorischen Axone folgenden Spinalganglien crush-Monitor beschrieben. Die Verfahren nutzen wide-field Fluoreszenzmikroskopie und THY1-YFP transgenen Mäusen, und erlauben wiederholte Bildgebung Axonregeneration über 4 cm im PNS und Axon Wechselwirkungen mit der Oberfläche des ZNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

Die primären sensorischen Axone, die bei Verletzungen der Spinalnervenwurzeln geschädigt werden, regenerieren nicht in das Rückenmark hinein, was zu chronischen Schmerzen und einem dauerhaften sensorischen Verlust führt. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Regeneration der dorsalen Wurzel zu untersuchen, um eine Methode zu finden, die nach Verletzungen der Rückenwurzel eine signifikante Regeneration auslöst. Dies wird erreicht, indem zunächst eine spinale hemi-Laminektomie durchgeführt wird, die die rechte L5-dorsale Wurzel freilegt und die Visualisierung von YFP-markierten positiven Axonen im Rückenmark und in der dorsalen Wurzel ermöglicht. Anschließend wird die L5-dorsale Wurzel vorsichtig gequetscht, um eine minimale Blutung sicherzustellen.Die Quetschstelle wird anschließend nach der Quetschung abgebildet, um die Position der verletzten dorsalen Wurzel in der Läsion zu überprüfen. Über mehrere Zeitpunkte hinweg werden die Verletzungsstelle und die Eintrittszone der dorsalen Wurzel abgebildet, um die Fähigkeit der geschädigten Axone zur Regeneration in das Rückenmark zu bestimmen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass regenerierende Axone rasch immobilisiert werden und stationär verbleiben, während sie in die Eintrittszone der dorsalen Wurzel oder DREZ eintreten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Bildgebung an einem toten Tier besteht darin, dass wir dieses System über einen Zeitraum von Wochen oder sogar Monaten wiederholt an einem lebenden Tier abbilden können. Legen Sie zunächst eine thermostatisch geregelte Heizplatte unter ein fluoreszierendes Stereomikroskop und stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 32,5 Grad Celsius ein. Erwärmen Sie eine sterile Ringer-Lösung auf 32,5 Grad Celsius vor, um während der Operation das Rückenmark zu spülen. Während der Operation wird das Tier mit einer intraperitonealen Injektion eines Xylazin-Ketamin-Cocktails anästhesiert. Eine Anfangsdosis des Analgetikums Buprenorphin wird zudem subkutan verabreicht.Ein geeigneter Anästhesiegrad ist erreicht, wenn der tastbare Reflex fehlt und das Tier nicht auf einen Zehenquetsch reagiert. Sobald die Anästhesie bestätigt ist, rasieren Sie den oberen Rücken mit einem Kleintiertrimmer und verteilen Sie mit Wattestäbchen einen kleinen Tropfen Haarentfernungscreme auf der rasierten Stelle. Wenige Minuten später entfernen Sie die aufgetragene Creme und jedes verbliebene Fell mit Seifenwasser.Schließlich das Operationsfeld vollständig mit mit 70 %igem Ethanol getränkten Gazetupfern reinigen. Das Tier auf die Heizplatte legen und die Haut mit mit 70 %igem Ethanol getränkten Tupfern desinfizieren. Ein steriles chirurgisches Tuch sollte angebracht werden, jedoch aus Demonstrationszwecken.In diesem Video nicht gezeigt. Führen Sie unter Hellfeldbeleuchtung am Stereomikroskop einen zwei bis drei Zentimeter langen medianen Schnitt in der Haut des Rückens durch. Falls erforderlich, verwenden Sie Wattestäbchen, um die Blutung zu stillen.Reflektieren Sie die Rückenmuskulatur mit feinen Pinzetten und Knochenzangen, um die darunterliegenden Lendenwirbel freizulegen. Legen Sie die spinalen Segmente L3 bis S1 durch eine einseitige Hemi-Laminektomie von rechts unter Verwendung kleiner Räumhaken frei und spülen Sie die Kavität anschließend mit warmer steriler Ringer-Lösung aus.Platzieren Sie das Tier auf einem Stützkissen aus gerolltem Baumwollgaze, um die Wirbelsäule zu glätten. Verwenden Sie Retraktionshaken, um den exponierten Bereich zu vergrößern.Zu diesem Zeitpunkt, etwa 30 Minuten nach der ersten Injektion des Anästhetikums, sollte eine Auffülldosis injiziert werden, um das Tier vollständig anästhesiert zu halten. Wechseln Sie zur fluoreszierenden Anregung, um die mit FP markierten Axone sichtbar zu machen. Führen Sie mit der Spitze einer 27½-Gauge-Nadel einen kleinen Einschnitt in die Dura über der L5-Dorsalwurzel durch, spülen Sie wiederholt mit Ringer-Lösung und reinigen Sie vorsichtig mit Wattestäbchen.Identifizieren Sie die zu zerquetschende Stelle und fertigen Sie Bilder des gesamten freigelegten, unbeschädigten Bereichs an. Dies erleichtert die Identifizierung der Verletzungsstelle in nachfolgenden Bildgebungssitzungen. Danach wird eine Seite eines feinen Pinzettenpaares eingeführt.Schließen Sie die Pinzette sorgfältig, jedoch fest, um den medialen Abschnitt der L5-Wurzel für 10 Sekunden zu halten, und öffnen Sie die Pinzette dann vorsichtig wieder. Spülen Sie mehrfach mit physiologischer Lösung und reinigen Sie vorsichtig mit Wattestäbchen. Erstellen Sie mehrere Aufnahmen des gesamten exponierten Bereichs, einschließlich der Quetschstelle und der DREZ, jeweils vor und unmittelbar nach der Quetschung bei niedriger und hoher Vergrößerung.Nach der Bildgebung wird ein dünnes, synthetisches Matrixmembranstück gefolgt von einer künstlichen Dura mater auf das exponierte Rückenmark gelegt, sodass beide präzise in das exponierte Rückenmarkfenster passen. Die Muskulatur wird mit sterilen Fünf-Null-Nähten verschlossen und der mediane Schnitt mit Wundclips verschlossen. Es werden Ringer-Lösungen subkutan injiziert, und Buprenorphin wird als postoperative Analgesie alle 12 Stunden über zwei Tage hinweg intramuskulär verabreicht.Betäuben Sie das Tier mit Xylazin und Ketamin, wie zuvor beschrieben, und entfernen Sie die Wundklammern und Nähte. Entfernen Sie die künstliche Dura und die dünnen synthetischen Matrixmembranflicken und bewahren Sie diese in einem sterilen Röhrchen mit Ringer-Lösung zur späteren Wiederverwendung auf. Entfernen Sie anschließend vorsichtig das angesammelte bindegewebige Narbengewebe mit der gebogenen Spitze einer 26-Gauge-Nadel und feinen Pinzetten, wobei Sie regelmäßig mit warmer Ringer-Lösung spülen.Exponieren Sie erneut das Operationsfeld, einschließlich der Quetschstelle und der Eintrittszone der dorsalen Wurzel, und lokalisieren Sie die in vorherigen Sitzungen abgebildeten YFP-markierten Axone zur Fortsetzung der Bildgebung während der Regeneration. Hier werden vier oberflächliche, mit YFP markierte Axone, die durch farbige Pfeile gekennzeichnet sind, unmittelbar nach der Quetschung dargestellt. Drei Tage nach der Quetschung bilden alle vier Axone ein einzelnes Neurit aus, das durch die Quetschstelle wächst, wie zwei Tage später hervorgehoben wird.Neurite verbleiben stabil, und es kommt zu keinem zusätzlichen Wachstum dieser oder anderer proximaler Axone. Am vierten Tag sind regenerierende Neurite dünner und schwächer beleuchtet als geschonte Axone. Wiederholte Abbildung dieser Axone an ihren Spitzen alle zwei oder drei Tage über einen Zeitraum von zwei weiteren Wochen zeigt, dass sie sich weder vorwärts bewegt noch sich zurückgezogen haben, sondern bewegungslos blieben, wobei die Spitzen und Schaftabschnitte einiger Axone anschwellen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die L-fünf-Dorsalwurzel exponiert, zerkleinert und beobachtet, um die Mechanismen besser zu verstehen, die axonale Regeneration verhindern oder fördern.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Cheah, M., et al. Injektion des Spinalwurzelganglion und Dorsale Root Crush Injury als Modell für die Regeneration des sensorischen Axons. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Injektion einer Virussuspension in die Spinalganglien (DRGs) und zur Induktion einer kontrollierten axonalen Verletzung über einen dorsalen Wurzelcrush bei einer anästhesierten Ratte. Das Protokoll umfasst die Freilegung der DRGs, die Verabreichung eines wachstumsfördernden...

Modellierung der sensorischen Axonregeneration bei einer Ratte mittels Injektion des Spinalganglion und Dorsalwurzelquetschverletzung

Quelle: Shannonhouse, J., et al. In vivo Kalzium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Spinalganglien. J. Vis. Exp. (2023). Das Video zeigt eine in vivo Calcium-Bildgebungstechnik zur Überwachung der neuronalen Aktivität in den Spinalganglien (DRG) einer transgenen Maus. DRG-Neuronen exprimieren einen Kalziumindikator, der die Fluoreszenzintensität bei Bindung an Kalzium erhöht. Mechanische oder thermische Reize, die auf eine Hinterpfote...

In vivo Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in den intakten Spinalwurzelganglien einer Maus

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

GABAergen präsynaptischen Hemmung ist ein leistungsfähiges hemmende Mechanismus im Rückenmark wichtig für die motorische und sensorische Signalintegration in Rückenmark-Netzwerke. Basiswert primären afferenten Depolarisation kann durch die Aufnahme von Hinterwurzel Potentiale (DRP) gemessen werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur in-vivo-Aufnahme von DRP in Mäusen.

Mess Spinal Präsynaptische Hemmung bei Mäusen durch Spinalgan Mögliche Aufnahme<em&gt; In Vivo</em

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zwei-Photonen-Anregungs-Zeitraffermikroskopie verwendet, um gleichzeitig die Dynamik von Axon- und Myelinverletzungen in Echtzeit zu visualisieren. Dieses vorgeschlagene Protokoll ermöglicht die Untersuchung sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Faktoren, die das Schicksal des zentralen myelinisierten Axons nach einer Verletzung beeinflussen und zu einer dauerhaften klinischen Behinderung beitragen können.

Ein Ex vivo Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Dieses Protokoll stellt die Verwendung einer Injektion eines dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches bei einer erwachsenen Ratte als Modell zur Untersuchung der sensorischen Axonregeneration dar. Dieses Modell eignet sich, um den Einsatz von Gentherapie zur Förderung der sensorischen Axonregeneration zu untersuchen.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Das vorliegende Protokoll beschreibt in vivo Calcium-Bildgebung zur Messung der Reaktionen von Ensembles von lumbal-6 DRG-Neuronen auf somatische und viszerale Reize. Neuronen, die auf unterschiedliche Reize reagieren, lassen sich gründlich vergleichen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Untersuchung von Mechanismen des viszeralen Schmerzes und der somatischen Stimulation, wie z. B. der Akupunktur.

im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung der Reaktion von Neuronen der Spinalganglien auf somatische und viszerale Reize

Diese Studie stellt eine chirurgische Manipulation vor, um das T-DRG in anästhesierten Mäusen für die in vivo Kalziumbildgebung freizulegen, zusammen mit synchronen EKG-Aufzeichnungen. Diese Methode stellt ein hochmodernes Werkzeug dar, um die periphere elektrische Nervenstimulation und die Eingänge der thorakalen viszeralen Organe sowie deren Wechselwirkungen auf der primären sensorischen Ebene zu untersuchen.

In-vivo-Calcium-Bildgebung und EKG-Aufzeichnung von thorakalen dorsalen Wurzelganglien (DRG) zur Untersuchung der peripheren Nervenstimulation

Erfahren Sie die In-vivo-Bildgebung von dorsalen Wurzelaxonen nach Rhizotomie bei thy1-YFP-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die wiederholte Beobachtung der Axonregeneration am Rückenmarkseintritt über mehrere Wochen.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

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