Detektion physiologischer Reaktionen von sensorischen Neuronen in Drosophila

Befestigen Sie einen betäubten genetisch veränderten Drosophila melanogaster auf der Seite an einem Deckglas.

Strecken Sie die Vorderbeine aus und sichern Sie sie, um die Fußwurzelsegmente freizulegen.

Diese Segmente haben gustatorische Neuronen, die Kalziumindikatorkomplexe exprimieren, die in kalziumgebundener Form fluoreszieren.

Ziehe eine hydrophobe Barriere um die Fliege, um die Lösung zurückzuhalten.

Lassen Sie die Fliege sich erholen und legen Sie eine gepufferte Kochsalzlösung auf die freiliegenden Fußwurzelsegmente, um sie zu befeuchten.

Beobachten Sie unter einem konfokalen Mikroskop Tarsalsegmente und bilden Sie die gustatorischen Neuronen in verschiedenen Tiefen ab, um eine Fluoreszenz vor der Stimulation zu erhalten.

Geben Sie eine Stimulationslösung, die lipophile Liganden enthält, auf das Segment.

Diese Liganden binden an die gustatorischen Neuronenrezeptoren, initiieren Signalwege und lösen die Öffnung von Kalziumkanälen aus.

Dadurch können Kalziumionen aus der extrazellulären Flüssigkeit in das Zytoplasma eindringen und an die Kalziumindikatorkomplexe binden, was zu einer Fluoreszenzemission führt.

Bei erneuter Beobachtung bestätigt eine Zunahme der neuronalen Fluoreszenz die neuronale physiologische Reaktion auf den Liganden.

Nachdem Sie die Fliege betäubt haben, befestigen Sie sie mit einem sehr kleinen Tropfen klarem Nagellack an einem 0,17 Millimeter dicken Deckglas. Befestigen Sie die Seite des Hosenschlitzes mit dem gesamten Tropfen an der Rutsche. Verwenden Sie anschließend unter einem Präpariermikroskop einen nassen Pinsel, um ein Vorderbein der Fliege zu verlängern. Befestigen Sie dann mit zwei sehr dünnen Klebebandstreifen das erste und fünfte Tarsalsegment am Deckglas.

Wenn Neuronen im Rüssel abgebildet werden sollen, legen Sie einen weiteren dünnen Streifen Klebeband über das Rostrum des Rüssels, um das Labellum freizulegen. Mache nun mit einem PAP-Stift eine kurze Wand um die Fliege. Lassen Sie die Narkose eine halbe Stunde lang abklingen, bevor Sie Messungen vornehmen. Bereiten Sie für dieses Protokoll die erforderlichen Verdünnungen der 1-Milligramm-pro-Milliliter-Stammligandenlösung unter Verwendung von PBST vor.

Um den Eingriff zu beginnen, überlagern Sie die gesicherten und freiliegenden Fußwurzelsegmente mit 10 Mikrolitern PBST. Dadurch wird das Bein mit Feuchtigkeit versorgt und verhindert, dass es unscharf wird. Konzentrieren Sie sich als Nächstes auf die Segmente mit einem optischen System, das ein gutes Fluoreszenzsignal mit schneller Zeitauflösung erzielen kann, wie z. B. ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop mit einer sCMOS-Kamera. Sammeln Sie drei Vorstimulations-Z-Stapel der interessierenden Neuronen im Tarsalsegment.

In diesem Beispiel werden Bilder mit einer Belichtungszeit von 200 Millisekunden und einem 2-mal-2-Binning über einen 6 Mikrometer x 1/2 Mikrometer-Schnitt alle zwei Sekunden aufgenommen. Achten Sie darauf, die Leistung des Lasers zu optimieren, um das Photobleaching zu minimieren und gleichzeitig ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu ermöglichen. Hier wird ein 491 Nanometer großer 100-Milliwatt-Laser mit 30 % Transmission betrieben.

Das Signal muss vor der Stimulation nachweisbar sein, darf sich aber nicht der Sättigung nähern. Pipettieren Sie nun 10 Mikroliter Stimulationslösung auf das interessierende Fußwurzelsegment. Seien Sie beim Pipettieren sehr vorsichtig, um das Bein oder den Körper der Fliege nicht zu berühren, da sich sonst die Tarsen aus ihrer Position bewegen. Nehmen Sie dann sofort die ersten Bilder nach der Stimulation auf und sammeln Sie weiterhin genügend Bilder, um die maximale Änderung der Fluoreszenz zu dokumentieren.