JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:42 Min. • July 8th, 2025
Geben Sie ein lebendes neuromuskuläres Präparat aus Drosophila-Larven in eine Aufzeichnungskammer, die kalziumfreie Kochsalzlösung enthält.
Die Neuronen der Larve exprimieren einen lichtempfindlichen Kationenkanal.
Wechseln Sie zu einer mit Kalzium versetzten Kochsalzlösung, die einen Fluoreszenzfarbstoff enthält.
Der Farbstoff fluoresziert schwach im nicht-internalisierten Zustand, aber stark, wenn er von den Neuronen internalisiert wird.
Beleuchten Sie die Larve mit blauem Licht.
Dies aktiviert den Kanal, induziert einen Kationeneinstrom und eine Neuronendepolarisation und initiiert ein Aktionspotential.
Das Aktionspotential erreicht das synaptische Terminal an der neuromuskulären Verbindung, was den Kalziumeinstrom und die Vesikelexozytose ermöglicht.
Anschließend wird die farbstoffgebundene Membran während des Vesikelrecyclings internalisiert.
Mit kalziumfreier Kochsalzlösung waschen, um das Recycling von Vesikeln zu stoppen und nicht internalisierte Farbstoffe zu entfernen.
Visualisieren Sie das Fluoreszenzsignal.
Geben Sie dann farbstofffreie, mit Kalzium versetzte Kochsalzlösung hinzu und beleuchten Sie sie erneut.
Dies induziert ein weiteres Aktionspotential, den Kalziumeinstrom und die farbstoffhaltige Vesikelexozytose.
Visualisieren Sie das Signal erneut.
Die Farbstofffreisetzung durch Vesikelexozytose reduziert die Fluoreszenz im Vergleich zum Zustand während der Vesikelinternalisierung.
Für die Stimulation von Kanalrhodopsin befestigen Sie eine blaue LED mit einem Koaxialkabel an einem programmierbaren Stimulator und platzieren Sie die LED in den Kameraanschluss. Fokussieren Sie den blauen LED-Lichtstrahl mit der Zoom-Funktion des Mikroskops auf das Präparat mit FM-Farbstoff
.Der wichtigste Schritt an diesem Punkt des Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass die LED-Einstellungen konstant gehalten werden und dass Sie unter allen verglichenen Bedingungen den gleichen Teil jedes Tieres beleuchten, um eine gleichbleibende Stimulationsstärke zu gewährleisten.
Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen Sie mit dem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode. Wenn der Timer stoppt, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch kalziumfreie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen. Für die Entladung des FM-Farbstoffs starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit dem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode. Wenn die Timer-Periode abgelaufen ist, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch kalziumfreie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen.