Optogenetische Elektrophysiologie Erfassung von Zellen mit lichtabhängigen Ionenkanälen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:54 Min. • July 8th, 2025
Legen Sie ein Deckglas mit embryonalen Nierenzellen, die lichtabhängige Ionenkanäle exprimieren, und ein fluoreszierendes Reporterprotein auf eine mit Silikon aufgetragene Messkammer. Schließen Sie ihn und fügen Sie einen externen Puffer hinzu.
Positionieren Sie diese Kammer unter einem Mikroskop. Lege eine mit Agar gefüllte Badeelektrode auf. Perfusion mit einem Puffer, um Medienreste und abgestorbene Zellen zu entfernen.
Identifizieren Sie mit einem Fluoreszenzfilter die Zielzelle und fokussieren Sie sie.
Befestigen Sie eine Patch-Pipette an einem Mikromanipulator. Üben Sie Druck aus, um ein Verstopfen zu verhindern, und nähern Sie sich der Zelle.
Positionieren Sie die Pipette in der Nähe der Zelle und lassen Sie den Überdruck ab, um an der Spitze ein Membranpflaster zu bilden.
Üben Sie nach dem Formen des Membranpflasters Unterdruck aus, um die Membran zu brechen.
Wenden Sie ein Licht einer bestimmten Wellenlänge an, um die Ionenkanäle zu öffnen. Die Bewegung der Ionen wird als Spannungsänderung durch die Elektrode aufgezeichnet.
Versiegeln Sie zunächst die Messkammer mit Silikon, um ein Auslaufen des externen Puffers zu verhindern. Legen Sie dann ein Deckglas in die Kammer und schließen Sie es. Füllen Sie die Kammer vorsichtig mit extrazellulärem Puffer, um zu verhindern, dass sich die Zellen ablösen. Stellen Sie dann die Messkammer mit dem 40-fach-Objektiv zur Zellvisualisierung unter das Mikroskop
.Legen Sie anschließend eine Agarbrücke über die Badelektrode und setzen Sie diese zusammen mit dem Füllstandssensor und dem Perfusionsauslass des Badhandlers in die Kammer ein. Tauschen Sie die extrazelluläre Lösung zweimal gegen 1 Milliliter frische externe Lösung aus, um das restliche Kulturmedium und die abgelösten Zellen zu entfernen. Bringen Sie die Zellen in den Fokus und suchen Sie nach einer transfizierten Zelle, die von anderen Zellen isoliert werden muss. Verwenden Sie dann ein Triple-Band-Filterset und orangefarbenes Licht, um mCherry anzuregen und zu visualisieren.
Montieren Sie die Pipette auf dem Pipettenhalter und üben Sie einen positiven Druck aus, um ein Verstopfen der Spitze zu verhindern. Positionieren Sie die Spitze der Patch-Pipette unter dem Mikroskop und navigieren Sie sie mit dem Mikromanipulator nahe an die Zelle.
Starten Sie in der Datenerfassungssoftware den Membrantest im Badmodus und legen Sie einen Spannungsschritt an. Prüfen Sie, ob der Pipettenwiderstand im gewünschten Bereich von 1,3 bis 3,0 Megaohm liegt. Stellen Sie dann die Offset-Ströme auf Null und stellen Sie das Pipettenpotenzial ein, indem Sie den Pipetten-Offset-Knopf am Verstärker drehen.
Um ein Pflaster in der Ganzzellkonfiguration zu etablieren, nähern Sie sich der Zelle langsam mit der Patch-Pipette von oben und lassen Sie den Überdruck ab, kurz bevor Sie die Zelle berühren. Kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie den Knopf zur Kompensation der Pipettenkapazität drehen, um eine flache Reaktion des Testimpulses zu erhalten.
Schalten Sie den Membrantest in den Zellmodus. Brechen Sie dann das Pflaster, ohne die Versiegelung zu zerstören, indem Sie kurze Impulse mit Unterdruck oder Unterdruck mit zunehmender Stärke anwenden, um eine Ganzzellkonformation zu erhalten.
Starten Sie die Kompensation des Serienwiderstands, indem Sie die beiden Ganzzellenparameter, die Zellkapazität und den Serienwiderstand, einstellen. Erfassen Sie lichtinduzierte Ströme bei unterschiedlichen Haltepotentialen. Diese Abbildung zeigt, dass PSACR1 während der Beleuchtung mit grünem Licht einen schnellen transienten Strom aufweist, der schnell auf ein stationäres Stromniveau abfällt.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Aufzeichnung lichtinduzierter Ionenströme in embryonalen Nierenzellen mittels Patch-Clamp-Techniken beschrieben. Das Verfahren umfasst die Isolierung transfizierter Zellen und die Applikation spezifischer Lichtwellenlängen zur Aktivierung von Ionenkanälen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Elektrophysiologie
- Zelluläre Bildgebung
- Neurowissenschaftliche Methoden
Hintergrund
- Embryonale Nierenzellen können genetisch modifiziert werden, um lichtempfindliche Ionenkanäle zu exprimieren.
- Mit Patch-Clamp-Techniken lassen sich ionische Ströme über Zellmembranen messen.
- Fluoreszierende Reportereiweiße helfen dabei, spezifische Zellen während Experimenten sichtbar zu machen.
- Die Lichtaktivierung von Ionenkanälen liefert Erkenntnisse über zelluläre Reaktionen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Aufzeichnung von Ionenströmen als Reaktion auf Lichtstimulation etablieren.
- Die Funktionalität lichtabhängiger Ionenkanäle in einer kontrollierten Umgebung demonstrieren.
- Einen detaillierten Protokollansatz für Forscher bereitstellen, die an ähnlichen elektrophysiologischen Untersuchungen interessiert sind.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung von Deckgläsern mit embryonalen Nierenzellen.
- Verwendung einer mit Silikon versehenen Messkammer zur Verhinderung von Leckagen.
- Anwendung von Patch-Clamp-Techniken zur Bildung von Membran-Patches.
- Aufzeichnung von Spannungsänderungen als Reaktion auf Lichtreizung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bildung von Membranpatchs an Zielzellen.
- Beobachtung lichtinduzierter Ströme bei spezifischer Ionenkanalaktivierung.
- Charakterisierung der transienten und stationären Stromstärken während der Beleuchtung.
- Validierung der Methode für zukünftige elektrophysiologische Untersuchungen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode zeichnet effektiv lichtinduzierte Ionenströme auf.
- Diese Technik kann auf verschiedene Zelltypen angewandt werden, die lichtempfindliche Kanäle exprimieren.
- Weitere Studien können die Anwendungen dieser Methode in der Neurowissenschaftsforschung erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels optogenetischer Elektrophysiologie lässt sich die Funktion von Ionenkanälen in lebenden Zellen präzise untersuchen, was die Zielvalidierung in den Neurowissenschaften und der Pharmakologie unterstützt. Indem Lichtstimulation mit messbaren elektrophysiologischen Ausgangssignalen verknüpft wird, liefert die Methode quantitative Daten zur mechanistischen Risikominderung von Ionenkanalmodulatoren. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er eine reproduzierbare, lichtgesteuerte Bewertung der Kanalselektivität und Kinetik ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung lichtabhängiger Ionenkanäle als therapeutische Zielstrukturen durch direkte Messung des Ionenflusses.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur Beurteilung der Kanalselektivität und Kinetik unter kontrollierter Lichtstimulation.
- Strategischer Wert: Unterstützt die hypothesengetriebene Untersuchung von Substanzen, die die Kanalaktivität in einem physiologisch relevanten Kontext modulieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, lichtgesteuerte Strommessungen, die für die Assay-Entwicklung und die Wirkstoff-Screening geeignet sind.
- Operationaler Wert: Etabliert einen standardisierten elektrophysiologischen Endpunkt für die Ionenkanalaktivität mit zeitlicher Präzision.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Wirkstoffeffekte auf die Kanalfunktion und verbessert so die Effizienz der Hit-Validierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Charakterisierung von krankheitsrelevanten Ionenkanal-Mutanten oder -Varianten in einem kontrollierten zellulären System.
- Operativer Wert: Unterstützt das präklinische Profiling von Ionenkanal-Modulatoren mittels einer skalierbaren, lichtaktivierten Plattform.
- Strategischer Wert: Verbessert die translationale Kontinuität, indem eine Brücke zwischen der in-vitro-Elektrophysiologie und in-vivo-Optogenetik-Modellen geschlagen wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie einen lichtgesteuerten elektrophysiologischen Test für die Charakterisierung von Ionenkanälen bereitstellt und die Identifizierung von Leitsubstanzen durch funktionelle Validierung unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung der Ionenkanalfunktion durch lichtabhängige Aktivierung und Strommessung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative elektrophysiologische Daten zur Beurteilung der Wirkung von Verbindungen auf die Kanalaktivität.
- Analytik: Erzeugt Aufzeichnungen von Spannungsänderungen, die den Vergleich des Ionenflusses unter verschiedenen Bedingungen und Lichtintensitäten ermöglichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Risikobewertung, indem funktionelle Vergleiche zwischen Wildtyp- und Mutantenkanälen ermöglicht werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung von Ionenkanälen über mehrere Zielstrukturen und Verbindungsreihen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch direkte, lichtgesteuerte Messung der Ionenkanalfunktion.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays durch optogenetische Steuerung der Kanalaktivierung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem die mechanistische Unsicherheit hinsichtlich der Wirksamkeit von Ionenkanalmodulatoren verringert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Ionenkanalzielen basierend auf validierten elektrophysiologischen Profilen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und in optogenetischen Methoden.
- Ist abhängig von Fluoreszenzmikroskopie und Lichtabgabesystemen zur Kanalaktivierung.
- Setzt einen stabilen Ausdruck lichtabhängiger Ionenkanäle und fluoreszierender Reporter in Wirtszellen voraus.
- Beinhaltet die Optimierung von Lichtwellenlänge und -intensität, um Phototoxizität zu vermeiden und gleichzeitig eine ausreichende Kanalaktivierung sicherzustellen.
- Erfordert eine sorgfältige Kontrolle der Umgebungsbedingungen, um die Zellgesundheit während längerer Ableitsitzungen aufrechtzuerhalten.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Optogenetische Stimulation des Hörnervs
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Optogenetische Functional MRI
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026