Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an intakten Spinalwurzelganglien der Ratte

Nehmen Sie immobilisierte dorsale Wurzelganglien (DRG) der Ratte in eine Aufzeichnungskammer, die mit aCSF durchblutet ist.

DRG enthält sensorische Neuronen, die von Satelliten-Gliazellen umgeben sind.

Üben Sie positiven Druck auf eine Patch-Pipette aus, die mit intrazellulärer Lösung gefüllt und mit einem Verstärker verbunden ist, und schieben Sie sie dann in Richtung des Zielneurons.

Der Überdruck hilft, die umgebende Gliazellschicht des Satelliten zu durchqueren und mit dem Neuron in Kontakt zu treten, wodurch eine Vertiefung auf seiner Membran entsteht.

Üben Sie Unterdruck aus, um eine dichte Abdichtung mit der Membran zu bilden.

Legen Sie anschließend Unterdruckimpulse an, um die Konfiguration der gesamten Zelle festzulegen. Kalibrieren Sie die Verstärkerparameter für genaue Signalmessungen.

Um die Erregbarkeit des Neurons zu bestimmen, legen Sie kurze inkrementelle Ströme in das Neuron an, die die spannungsgesteuerten Ionenkanäle öffnen und ein Aktionspotential auslösen.

Messen Sie die Rheobase, den minimalen Strom, der erforderlich ist, um ein Aktionspotenzial auszulösen.

Des Weiteren wird ein Rampenstrom angelegt, um das minimale Membranpotential zu messen, bei dem das Aktionspotential auftritt.

Legen Sie bei diesem Verfahren die Elektrodenlösung auf Eis, um eine Degradation zu verhindern. Füllen Sie anschließend die Glaspflasterpipette mit gefilterter intrazellulärer Lösung. Setzen Sie dann die Pipette in den Pipettenhalter der Kopfstufe ein.

Üben Sie durch eine 5-Milliliter-Spritze einen sanften Überdruck auf die Pipette aus, indem Sie den Kolben um etwa 1 Milliliter verschieben, bevor Sie die Pipette in die Badlösung absenken. Wählen Sie anschließend den V-Clamp-Modus am Verstärker und öffnen Sie die Membrantestschnittstelle in der Software.

Bewegen Sie die Pipette unter dem Mikroskop nahe an das Zielneuron. Üben Sie anschließend positiven Druck von der Pipette aus, um die Schicht der Satelliten-Gliazellen zu durchqueren, bis eine plötzliche Vergrößerung des Raums zwischen dem Neuron und der umgebenden Schicht der Satelliten-Gliazellen beobachtet wird. Bewegen Sie dann die Pipette weiter in Richtung des Neurons, bis ein Grübchen auf dem Neuron zu sehen ist.

In unserer Präparation sind die Neuronen von Satelliten-Gliazellen umgeben. Um die Gliazellschichten zu durchdringen und einzelne Neuronen zu erreichen, wird die Aufzeichnungspipette daher auf einem hohen positiven Druck gehalten.

Reduzieren Sie danach den Überdruck. Erzielen Sie eine Gigaohm-Abdichtung mit sanftem Sog.

Um eine Ganzzellaufzeichnungskonfiguration zu erhalten, durchdringen Sie die Zellmembran der Neuronen durch kurzen, aber starken Sog.

Alternativ können Sie die Zap-Funktion am Verstärker verwenden, während die Saugkraft angelegt ist.

Sobald ein Ganzzellenmodus eingerichtet ist, kompensieren Sie die Ganzzellenkapazität und den Serienwiderstand, indem Sie die Kapazitäts- und Widerstandskompensationsknöpfe am Verstärker drehen. Schließen Sie dann das Membrantestfenster. Wählen Sie den normalen I-Clamp-Modus, indem Sie den Modusknopf am Verstärker drehen.

Klicken Sie anschließend in der Software auf Protokoll öffnen. Wählen Sie das Protokoll für die Messung von Rheobase aus, laden Sie es und klicken Sie auf Aufzeichnen, um die Aufzeichnung zu starten. Um die neuronale Erregbarkeit zu untersuchen, messen Sie den Eingangswiderstand und die Rheobas, indem Sie eine abgestufte Reihe von depolarisierenden Strömen in Schritten von 100 Pikoampere injizieren.