Evaluierung von Bandsynapsen in bestimmten Frequenzbereichen der Maus-Cochlea

Beginnen Sie mit Röhrchen mit vorbehandelten Cochlea-Windungen der Maus mit einem permeabilisierenden Mittel und einem Blockierungsmittel, die unspezifische Wechselwirkungen verhindern.

Jede Umdrehung erkennt unterschiedliche Schallfrequenzen und enthält Haarzellen, die Schall in elektrische Signale umwandeln. Diese Signale werden über Neurotransmitter in Bandsynapsen an den Hörnerv weitergeleitet.

Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die mit Proteinen in Haar- und Nervenzellen an den Bandsynapsen interagieren, und waschen Sie sie dann.

Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern, die mit roten und grünen Fluorophoren markiert sind, die an ihre Primärantikörper binden.

Waschen, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen.

Legen Sie die Probe auf einen Objektträger mit einem Einbettmedium, das Kernfarbstoff enthält, um die Kerne blau zu färben.

Montieren Sie das Deckglas. Trocknen Sie es und verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop, um jedes Segment in verschiedenen Tiefen abzubilden.

Bandsynapsen erscheinen als eng beieinander liegende rote und grüne Punktu.

Zählen Sie diese funktionellen Punkte in jeder Umdrehung, um ihre Reaktion auf die Schallfrequenz zu korrelieren.

Legen Sie nach der Dissektion jede Cochlea-Umdrehung in einzelne 2,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 10 % Ziegenserum in PBS in 0,1 % Triton X-100 für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator.

Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Lösung unter einem Seziermikroskop zu entfernen. Inkubieren Sie die Proben mit den primären Antikörpern von Interesse, verdünnt in 5 % Ziegenserum in PBS und 0,1 % Triton X-100 über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Rotator.

Spülen Sie die Gewebeproben am nächsten Morgen dreimal für 5 Minuten mit kaltem 0,1 molaren PBS pro Waschgang, um alle verbleibenden primären Antikörper zu entfernen. Anschließend werden die Proben mit den entsprechenden Sekundärantikörpern markiert, die zwei bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem Rotator lichtgeschützt in 5 % Ziegenserum in PBS und 0,1 % Triton X-100 verdünnt sind.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben dreimal mit 0,1 molaren PBS wie gezeigt und überführen Sie die Proben in einzelne 35-Millimeter-Platten mit 0,1 molaren PBS. Geben Sie einen Tropfen DAPI-supplementiertes Einbettmedium auf den Objektträger und übertragen Sie die Proben von PBS auf das Eindeckmedium. Legen Sie eine Kante eines Deckglases auf jede Folie und lassen Sie sie los, damit die Deckgläser sanft fallen können. Anschließend trocknen Sie die Dias in einer Diabox bei 4 Grad Celsius über Nacht.

Um die Proben abzubilden, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit den entsprechenden Lasern und einer hochauflösenden 63-fach Ölimmersionslinse. Zur Erfassung von konfokalen Z-Stacks mit einer Größe von 8 Mikrometern aus jeder Cochlea-Umdrehung. Legen Sie für die Anzahl der synaptischen Punktzahlen die Z-Stapel mit einer Schrittweite von 0,3 Mikrometern so fest, dass sie sich über die gesamte Länge der inneren Haarzellen erstrecken, um sicherzustellen, dass alle synaptischen Punktzahlen abgebildet werden können, und fügen Sie die punktuellen Bilder in einem Stapel zusammen, um die Projektion der Z-Achse zu erhalten.

Importieren Sie die zusammengefügten Bilder in ein geeignetes Bildverarbeitungsprogramm. Teilen Sie die synaptische Gesamtanzahl in jedem Z-Stapel in bestimmten Frequenzbereichen durch die Anzahl der DAPI-positiven inneren Haarzellen, um die Anzahl der synaptischen Punkte für jede Zelle zu berechnen. In jedem spezifischen Frequenzbereich mittelst du alle synaptischen Punkte in 3 Bildern verschiedener mikroskopischer Felder, die 9 bis 11 innere Haarzellen enthalten.

Um die Architektur des Zytoskeletts und die synaptische Lokalisation besser zu visualisieren, verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um die synaptische Struktur und Verteilung der einzelnen inneren Haarzellen visuell zu beurteilen. Um die Gegenüberstellung von präsynaptischen Bändern und postsynaptischen Rezeptorfeldern zu untersuchen, verwenden Sie das rechteckige Auswahlrahmenwerkzeug, um den Voxelraum um die Bänder herum zu extrahieren, und verwenden Sie Bildschnitt, um die einzelnen Bänder zu isolieren. Klicken Sie dann auf Bild und Bildgröße, um ein Miniaturansichtsarray dieser Miniaturprojektionen zu erhalten, das zur Identifizierung von gekoppelten Synapsen im Vergleich zu verwaisten Bändern verwendet werden kann.