JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 1:58 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Zellkultur mit neuronalen Krebszellen, die an einem Deckglas befestigt sind, und halten Sie sie unter kalten Bedingungen.
Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen wiederholt mit kaltem Phosphatpuffer, um das restliche Medium zu entfernen.
Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, der eine geringe Konzentration an nichtionischen Detergenzien und Proteaseinhibitoren enthält.
Das nichtionische Detergens bricht die Zellmembran auf, um die Lyse einzuleiten.
Währenddessen blockieren die Proteaseinhibitoren die zellulären proteolytischen Enzyme und schützen so die Proteine vor enzymatischem Abbau.
Verwenden Sie anschließend einen Zellschaber, um die teilweise lysierten Zellen vom Deckglas zu lösen.
Übertragen Sie den Inhalt in ein Röhrchen mit dem Lysepuffer.
Verwenden Sie unter kalten Bedingungen einen Homogenisator, um die Zellen mechanisch zu lysieren, um eine vollständige Zelllyse und Proteinfreisetzung zu gewährleisten.
Zentrifugieren Sie das Zelllysat.
Sammle den Überstand in ein frisches Röhrchen.
Die extrahierten Proteine aus den neuronalen Tumorzellen stehen nun für die weitere Analyse bereit.
Zur Validierung der Proteinexpression stellen Sie die Kulturschalen 48 Stunden nach der Transfektion auf Eis und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Behandeln Sie die Zellen in jeder Schale mit 200 bis 400 Mikrolitern Lysepuffer und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen von den Deckgläsern zu entfernen.
Übertragen Sie die von jeder Platte abgelösten Zellen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und dissoziieren Sie die Zellen mit einem Homogenisator unter Eis weiter. Nach einer Minute pelletieren Sie die homogenisierten Zellstücke durch Zentrifugation.