Isolierung von zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen aus einer Astrozytenkultur

Nehmen Sie eine Astrozytenkultur und entfernen Sie das Medium. Fügen Sie einen physiologischen Puffer hinzu und inkubieren Sie auf Eis, wodurch die Endozytose von Proteinen auf der Zelloberfläche gehemmt wird.

Inkubieren Sie mit einem Biotinylierungsreagenz, das die Proteine der Zelloberfläche bindet.

Inkubieren Sie anschließend mit einem Quenchpuffer, um nicht umgesetzte Reagenz zu inaktivieren.

Fügen Sie einen kältephysiologischen Puffer hinzu und lösen Sie die Zellen mechanisch ab. Übertragen Sie die Zellen, zentrifugieren Sie sie und entsorgen Sie den Überstand.

Inkubieren Sie mit einem Lysepuffer, um die Zellen zu lysieren, wobei biotinylierte Zelloberflächen- und nicht-biotinylierte intrazelluläre Proteine freigesetzt werden.

Zentrifugieren, den Überstand auffangen und eine Fraktion mit Gesamtproteingehalt abtrennen.

Die verbleibende Fraktion wird unter Rühren mit Streptavidin-beschichteten Kügelchen inkubiert, die biotinylierte Proteine binden.

Schleudern Sie die proteingebundenen Kügelchen auf der Zelloberfläche herunter und trennen Sie den Überstand mit intrazellulären Proteinen.

Waschen Sie die Kügelchen unter Rühren, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen, zentrifugieren Sie dann und verwerfen Sie den Überstand, wobei die Proteine an der Zelloberfläche isoliert werden.

Die Fraktionen, die Gesamt-, Intrazellular- und Zelloberflächenproteine enthalten, sind bereit für die Analyse.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, nehmen Sie die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium durch Aspiration. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 Millilitern gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerstoßenes Eis.

Entfernen Sie das CM-PBS durch Aspiration und pipettieren Sie dann zwei Milliliter Biotinpuffer in jede Vertiefung. Kippen Sie die Schalen einige Male vorsichtig hin und her, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten, bevor Sie die Kulturen 30 Minuten lang auf Eis legen.

Entfernen Sie anschließend den Biotin-Puffer, ersetzen Sie ihn durch vier Milliliter Quenching-Puffer und halten Sie die Kulturen 10 Minuten lang auf Eis. Anschließend aspirieren und durch die gleiche Menge des Quenching-Puffers ersetzen, bevor die Kulturen 10 Minuten lang auf Eis gelassen werden.

Entsorgen Sie dann den Quenching-Puffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 Millilitern gekühltem CM-PBS. Anschließend werden die Zellen in einen Milliliter gekühltes CM-PBS abgeschabt und die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 100 g drei Minuten lang in einer gekühlten Mikrozentrifuge auf 4 Grad Celsius pelletiert. Verwerfen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer

Lassen Sie die Proben dann 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle fünf Minuten vortexen. Anschließend zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um alle Reinigungsmittel und löslichen Materialien zu pelletieren. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Sparen Sie 50 Mikroliter des Lysats und fügen Sie 25 Mikroliter 3x Ladepuffer hinzu.

denaturieren Sie es, indem Sie es in einem trockenen Bad auf 95 Grad Celsius erhitzen. Dies ist die Eingangsfraktion, die sowohl biotinylierte Zelloberflächenproteine als auch nicht-biotinylierte zytosolische Proteine enthält. Übertragen Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze 75 Mikroliter Streptavidin-Agarose-Kügelchen in das Lysat und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei 4 Grad Celsius auf einem Shaker.

Danach pelletieren Sie die Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Sparen Sie 50 Mikroliter des Überstands und fügen Sie 25 Mikroliter 3x Ladepuffer hinzu. Anschließend denaturieren Sie es bei 95 Grad Celsius in einem Wasserbad oder einem Heizblock. Diese stellt die intrazelluläre Fraktion dar und besteht hauptsächlich aus nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen.

Anschließend werden die pelletierten Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer resuspendiert und drei Minuten lang bei 4 Grad Celsius geschüttelt. Kügeln Sie die Kügelchen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal, um die unspezifische Bindung von nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren.

Fügen Sie 50 Mikroliter Ladepuffer hinzu, der mit Lysepuffer auf 1x verdünnt ist. Geben Sie Biotin und Streptavidin aus den Kügelchen ab, indem Sie sie bei 95 Grad Celsius denaturieren. Diese Fraktion sollte nur biotinylierte Zelloberflächenproteine enthalten.