Isolierung von zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen aus einer Astrozytenkultur

Nehmen Sie eine Astrozytenkultur und entfernen Sie das Medium. Fügen Sie einen physiologischen Puffer hinzu und inkubieren Sie auf Eis, wodurch die Endozytose von Proteinen auf der Zelloberfläche gehemmt wird.

Inkubieren Sie mit einem Biotinylierungsreagenz, das die Proteine der Zelloberfläche bindet.

Inkubieren Sie anschließend mit einem Quenchpuffer, um nicht umgesetzte Reagenz zu inaktivieren.

Fügen Sie einen kältephysiologischen Puffer hinzu und lösen Sie die Zellen mechanisch ab. Übertragen Sie die Zellen, zentrifugieren Sie sie und entsorgen Sie den Überstand.

Inkubieren Sie mit einem Lysepuffer, um die Zellen zu lysieren, wobei biotinylierte Zelloberflächen- und nicht-biotinylierte intrazelluläre Proteine freigesetzt werden.

Zentrifugieren, den Überstand auffangen und eine Fraktion mit Gesamtproteingehalt abtrennen.

Die verbleibende Fraktion wird unter Rühren mit Streptavidin-beschichteten Kügelchen inkubiert, die biotinylierte Proteine binden.

Schleudern Sie die proteingebundenen Kügelchen auf der Zelloberfläche herunter und trennen Sie den Überstand mit intrazellulären Proteinen.

Waschen Sie die Kügelchen unter Rühren, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen, zentr