Bewertung der anziehenden oder abstoßenden Aktivität von Proteinen mit Hilfe von Hippocampus-Neuronen

Beginnen Sie mit einer Schale, die eine Silikonmatrix enthält, die über mehrere kleine Kanäle verfügt, die mit den Einlass- und Auslassanschlüssen verbunden sind.

Injizieren Sie das Testprotein mit abstoßender Aktivität durch den Einlass, um die Kanäle zu füllen.

Inkubieren, um die Proteinadhärenz im Kanalbereich zu ermöglichen, Testproteinzonen bilden und dann waschen.

Entfernen Sie die Matrix, überlagern Sie die beschichtete Fläche mit einem Kontrollprotein mit attraktiver Aktivität und inkubieren Sie.

Dies erleichtert die Adhärenz des Kontrollproteins an den leeren Bereichen zwischen den Testproteinzonen, wodurch Kontrollproteinzonen mit einem abwechselnden Streifenmuster entstehen und dann gewaschen werden.

Fügen Sie Laminin hinzu, um den gestreiften Bereich zu beschichten, und waschen Sie ihn dann.

Besiedeln Sie den beschichteten Bereich mit einer einzelligen Suspension aus Hippocampus-Neuronen und inkubieren Sie.

In der Testproteinzone interagieren die Neuronen mit den Proteinen und lösen Signale aus, die dazu führen, dass sich die Neuronen abstoßen und ihre Anheftung hemmen.

Im Gegensatz dazu fördern Neuron-Protein-Interaktionen in der Kontrollproteinzone die neuronale Anheftung und unterstützen deren Wachstum und Axonausdehnung

Bereiten Sie die fluoreszenzmarkierten rekombinanten Proteine in PBS vor. Machen Sie 25 Mikroliter für jede Streifenschale. Lassen Sie die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Laden Sie dann für jede Schale eine 22-Gauge-Spritze mit 25 Mikrolitern verdünntem Protein und injizieren Sie es durch das kleine Loch an der Seite der Matrix.

Vermeiden Sie die Injektion von Luftblasen in die Matrices, da diese die Bindung Ihrer Proteine an die Krankheit stören.

Inkubieren Sie die Schalen nun für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator. Nach der Inkubation geben Sie 300 Mikroliter PBS in den oberen Schlitz jeder Matrix. Aspirieren Sie dann das PBS aus einem kleinen Loch an der Seite jeder Matrix, um alle nicht gebundenen rekombinanten Proteine zu entfernen. Aspirieren Sie das PBS nicht vollständig, da die Proteine sonst austrocknen.

Führen Sie diese PBS-Spülung insgesamt dreimal durch. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Matrix von jeder Schale. Fügen Sie dann sofort etwa 100 Mikroliter Kontrollprotein über die gesamte gestreifte Fläche hinzu, wodurch eine alternative Beschichtung auf jeder Schale entsteht.

Anschließend werden die Gerichte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. In der Zwischenzeit tauen Sie auf Eis Laminin in PBS bei 20 Mikrogramm pro Milliliter auf. Spülen Sie das Geschirr nach 30 Minuten dreimal mit PBS. Bestreichen Sie dann jede Schale mit etwa 100 Mikrolitern kaltem Laminin und stellen Sie die Schalen für eine weitere Stunde in den Inkubator.

Eine Stunde später spülen Sie das Geschirr mit PBS erneut dreimal ab. Geben Sie nach dem dritten Waschgang etwa 150 Mikroliter Nährmedium in jede Schale. Inkubieren Sie die Schalen dann in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, bis sie das nächste Mal benötigt werden. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und spielen Sie 10.000 Neuronen in 150 Mikrolitern Nährmedien auf jeder vorbereiteten Streifenplatte. Tragen Sie die Suspension vorsichtig auf, um den gesamten Streifenbereich zu bedecken.