Quantifizierung von filamentösem Aktin puncta in kortikalen Neuronen der Ratte

Nehmen Sie die primären kortikalen Neuronen der Ratte in einer polymerbeschichteten Schale mit Glasboden.

Fixieren Sie die Neuronen mit Paraformaldehyd, um die Zellstrukturen zu erhalten.

Waschen Sie das überschüssige Paraformaldehyd ab.

Fügen Sie ein nichtionisches Detergens hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren.

Behandeln Sie die Zellen mit einem grün fluoreszierenden Farbstoff, der auf das Strukturprotein filamentöses Aktin oder F-Aktin abzielt.

Entfernen Sie den überschüssigen Fleck.

Tragen Sie ein Blockierungsmittel auf, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf dendritische Proteine abzielen.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper.

Fügen Sie rote Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper hinzu, um an die Primärantikörper zu binden. Waschen Sie die überschüssigen Antikörper ab.

Tragen Sie einen Fluoreszenzfarbstoff auf, um die Zellkerne zu färben. Entfernen Sie den ungebundenen Farbstoff.

Fügen Sie ein Antifading-Reagenz hinzu, um Fluorophor-Photobleiche zu verhindern.

Nehmen Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie Bilder der Neuronen auf.

Identifizieren Sie eine F-Aktin-reiche Region innerhalb des markierten Dendriten.

Zählen Sie mit Hilfe einer Software die F-Aktin-Punkte oder -Flecken und verfolgen Sie manuell die Länge des Dendriten, um die F-Aktin-Dichte zu berechnen.

Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd, gefolgt von zwei PBS-Wäschen. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 in PBS und markieren sie mit einer F-Aktin-spezifischen Färbung bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen nach 20 Minuten zweimal mit PBS und blockieren Sie jede unspezifische Färbung der Zelloberfläche mit 10 % normalem Ziegenserum.

Am Ende der Inkubation markieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 Grad Celsius mit polyklonalem Anti-MAP2-Antikörper aus dem Huhn. Spülen Sie die Zellen am nächsten Morgen zweimal mit PBS und markieren Sie sie mit dem entsprechenden Sekundärantikörper.

Spülen Sie die Zellen nach zwei Stunden bei Raumtemperatur erneut mit PBS und markieren Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 Mikrolitern Hoechst. Waschen Sie dann die Zellen zwei letzte Male mit PBS und konservieren Sie sie mit 100 Mikrolitern Anti-Fade-Reagenz.

Schalten Sie innerhalb von drei Tagen nach der Färbung das Fluoreszenzmikroskop ein und wählen Sie das 20-fach-Objektiv. Stellen Sie anschließend in der Mikroskopsoftware die Pixelbildgröße auf 1.600 x 1.200 und die Bildauflösung von 0,17 Mikrometern pro Pixel auf 1x Zoom ein. Übertragen Sie die Zellschale auf den Mikroskoptisch und nehmen Sie Bilder der co-markierten F-Aktin-MAP2-Neuronen unter den grünen und roten Fluoreszenzkanälen auf.

Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, wählen Sie fünf Bilder einzelner Neuronen in den grünen, roten und blauen Kanälen mit klar definierten dendritischen Dornen aus und verwenden Sie eine kontinuierliche MAP2-Immunfluoreszenz, um die F-Aktin-reichen Strukturen in den dendritischen Segmenten zweiter Ordnung zu identifizieren. Drehen Sie den ausgewählten Bildbereich horizontal, kopieren Sie den Bereich und fügen Sie ihn als neues Bild ein.

Subtrahieren Sie dann die Fluoreszenz des Bildhintergrunds und verwenden Sie die Software, um die Anzahl der hellgrünen F-Aktin-Puncta zu zählen. Verwenden Sie trainierte unabhängige Beobachter, um die Länge der ausgewählten dendritischen Segmente zu messen, und exportieren Sie dann die Punktzahlen und die Längendaten der dendritischen Segmente in eine Tabellenkalkulationsdatei.

Stellen Sie sicher, dass die Beobachter F-Aktin-positive Punktta mit einer maximalen Fluoreszenzintensität von mindestens 50 % über der durchschnittlichen Färbeintensität im dendritischen Schaft in jedem ausgewählten Segment einbeziehen.

Berechnen Sie schließlich die Dichte gemäß der Formel, indem Sie die Daten als Anzahl der F-Aktin-Puncta pro 10 Mikrometer Dendriten ausdrücken.