JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:38 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie einen Extrakt aus Hirngewebe der Maus, der Nicht-Amyloid-Proteine und Amyloidfibrillen, ein unlösliches Proteinaggregat, enthält.
Feste Saccharose hinzufügen und mischen, wobei die Dichte der Lösung erhöht wird.
Übertragen Sie es und zentrifugieren Sie, um dichtere Proteine von Ablagerungen zu trennen.
Den Überstand verwerfen, das Pellet in einem Puffer mit höherer Saccharosekonzentration resuspendieren, mischen und zentrifugieren.
Sammeln Sie die oberste Schicht mit einigen Amyloidfibrillen in einer frischen Tube, fügen Sie einen Waschpuffer hinzu und mischen Sie.
Entsorgen Sie nun die mittlere Schicht und übertragen Sie das mit Amyloidfibrillen angereicherte Pellet in das Röhrchen mit der obersten Schichtfraktion, um eine maximale Isolierung zu gewährleisten.
Die kombinierten Fraktionen werden zentrifugiert und der Überstand verworfen. Fügen Sie einen Verdauungspuffer hinzu und inkubieren Sie, um ausschließlich Nicht-Amyloid-Proteine abzubauen.
Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Waschen Sie das Pellet, um verdaute Proteinreste zu entfernen.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem Solubilisierungspuffer auf Saccharosebasis, der ein Detergens enthält, das die verbleibenden Nicht-Amyloid-Proteine auflöst.
Zentrifuge, den Überstand entfernen und die isolierten Amyloidfibrillen resuspendieren.
Beginnen Sie damit, eine frisch präparierte oder schockgefrorene Hirngeweberegion in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen zu geben, das sechs bis acht Keramikkügelchen und frisch zubereiteten eiskalten Homogenisierungspuffer enthält. Mahlen Sie dann das Gewebe mit einem Kugelmühlen-Homogenisator bei 4.000 U/min mit zwei Zyklen von 30 Sekunden Ein- und Ausschaltimpuls. Geben Sie nun neun Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer zu dem einen Milliliter Hirngewebe-Homogenat in einem 15-Milliliter-Röhrchen und versiegeln Sie es mit Laborwachsfilmstreifen.
Um eine robuste Solubilisierung zu gewährleisten, lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei 4 Grad Celsius rotieren. Am nächsten Tag fügen Sie der Gewebeextraktsuspension feste Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 1,2 Mol hinzu. Gut mischen und bei 250.000 mal g für 45 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet in zwei Millilitern Homogenisierungspuffer mit 1,9 molaren Saccharose durch Verreiben resuspendiert und bei 125.000 g für 45 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation die oberste weiße feste Schicht in ein frisches Röhrchen überführen und in 1 Milliliter eiskaltem Waschpuffer durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren auflösen. Da das Pellet auch mit Amyloidfibrillen angereichert ist, verwerfen Sie die wässrige Mittelschicht und kombinieren Sie das Pellet mit der oberen Schicht, um eine höhere Ausbeute zu erzielen. Zentrifugieren Sie die kombinierten Fraktionen bei 8.000 g für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Pellet in 1 Milliliter eiskaltem Aufschlusspuffer resuspendiert und drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Wirbel inkubiert. Zentrifugieren Sie die Probe erneut, waschen Sie das Pellet zweimal in 1 Milliliter eiskaltem Tris-Puffer und zentrifugieren Sie erneut. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Solubilisierungspuffer, indem Sie auf und ab pipettieren, und zentrifugieren Sie das Röhrchen schnell bei 200.000 mal g für 60 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Bewahren Sie das Pellet auf und reduzieren Sie dann die Saccharosekonzentration von 1,3 auf 1 molaren Puffer, indem Sie dem Überstand 50 millimolare Tris-Puffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie den Überstand erneut, lösen Sie dann beide Pellets in 100 Mikrolitern Tris-Puffer mit 0,5 % SDS auf. Für die Amyloid-Reinigung lösen Sie die amyloidreichen Pellets mit Ultraschallwellen in einem Badbeschallungsgerät für 20 Zyklen. Zentrifugieren Sie das Material dann sofort bei 20.000 g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern 0,5 % SDS-Tris-Puffer und wiederholen Sie das Waschen noch viermal. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt waschen Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Reinstwasser und zentrifugieren Sie es 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 20.000 g Celsius, um alle Reinigungsmittelreste zu entfernen. Das endgültige Pellet mit den gereinigten Amyloidfibrillen wird in 100 Mikrolitern Reinstwasser aufgelöst.