Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit in einer Kleinhirn-Neuronenkultur mittels Doppelfärbung

Beginnen Sie mit einer Kulturplatte, die mit einem Antimitotikum behandelt wurde, das das Wachstum der Gliazellen hemmt, so dass hauptsächlich Kleinhirn-Körnerneuronen und eine kleine Anzahl von Gliazellen übrig bleiben.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie langsam kalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS hinzu, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Ersetzen Sie den Puffer durch eine kalte Färbemischung und inkubieren Sie.

Dieses Gemisch enthält Fluoresceindiacetat oder FDA, eine nicht fluoreszierende Verbindung, und Propidiumiodid oder PI, einen membranundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff.

FDA diffundiert in Zellen, wo es von der funktionellen Esterase in lebenden Zellen in eine grün fluoreszierende Verbindung umgewandelt wird.

PI dringt durch beschädigte Membranen in tote Zellen ein, bindet an die DNA und emittiert rote Fluoreszenz.

Entfernen Sie die Färbelösung und fügen Sie kaltes PBS hinzu, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.

Erhalten Sie Fluoreszenzbilder für FDA- und PI-Färbungen sowie ein Phasenkontrastbild. Führen Sie die FDA- und PI-Bilder zusammen.

Vergleichen Sie dann dieses Fluoreszenzbild mit dem Phasenkontrastbild, das hilft, die großen G