Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit in einer Kleinhirn-Neuronenkultur mittels Doppelfärbung

Beginnen Sie mit einer Kulturplatte, die mit einem Antimitotikum behandelt wurde, das das Wachstum der Gliazellen hemmt, so dass hauptsächlich Kleinhirn-Körnerneuronen und eine kleine Anzahl von Gliazellen übrig bleiben.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie langsam kalte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS hinzu, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Ersetzen Sie den Puffer durch eine kalte Färbemischung und inkubieren Sie.

Dieses Gemisch enthält Fluoresceindiacetat oder FDA, eine nicht fluoreszierende Verbindung, und Propidiumiodid oder PI, einen membranundurchlässigen Fluoreszenzfarbstoff.

FDA diffundiert in Zellen, wo es von der funktionellen Esterase in lebenden Zellen in eine grün fluoreszierende Verbindung umgewandelt wird.

PI dringt durch beschädigte Membranen in tote Zellen ein, bindet an die DNA und emittiert rote Fluoreszenz.

Entfernen Sie die Färbelösung und fügen Sie kaltes PBS hinzu, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.

Erhalten Sie Fluoreszenzbilder für FDA- und PI-Färbungen sowie ein Phasenkontrastbild. Führen Sie die FDA- und PI-Bilder zusammen.

Vergleichen Sie dann dieses Fluoreszenzbild mit dem Phasenkontrastbild, das hilft, die großen Gliazellen auszuschließen.

Die rote Fluoreszenz zeigt den neuronalen Tod an, während die grüne Fluoreszenz die Lebensfähigkeit der Neuronen anzeigt.

Beginnen Sie die Färbung, indem Sie Fluoresceindiacetat mit einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und Propidiumiodid mit einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter in 10 Millilitern PBS mischen. Mischen Sie die FDA PI-Lösung durch Vortexen und legen Sie sie auf Eis. Legen Sie die Kulturplatte auf Eis.

Aspirieren Sie das Nährmedium vorsichtig, ohne die Zellen mit der Pipettenspitze zu berühren. Fügen Sie dann langsam kaltes PBS hinzu. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie dann kalte FDA PI oder FDA PI Hoechst Arbeitslösung hinzu. Legen Sie den Teller fünf Minuten lang auf Eis. Nachdem Sie die FDA PI oder FDA PI Hoechst Arbeitslösung abgesaugt haben, fügen Sie jeder Vertiefung kaltes PBS hinzu.

Stellen Sie sicher, dass das Fluoreszenzmikroskop richtig eingestellt ist. Detektieren Sie die Fluoreszenzemissionen für FDA PI und Hoechst bei 520, 620 bzw. 460 Nanometern mit einer Belichtungszeit zwischen 100 und 300 Millisekunden und einer analogen Verstärkung von 2,8X. Nachdem Sie Fluoreszenzbilder aufgenommen haben, nehmen Sie ein Bild unter normalem Licht mit dem Phasenkontrastmodus auf.

Für die FDA-PI-Doppelfärbung überlagern Sie die Bilder der Zellen, indem Sie die FDA-positive Schicht auf die PI-positive Schicht in der Grafikbearbeitungssoftware ziehen. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie 50 % in das Deckkraftfeld des Ebenenbedienfelds eingeben. Führen Sie zwei Ebenen zusammen, indem Sie das Ebenenmenü öffnen und auf die Schaltfläche Sichtbare zusammenführen klicken. Stellen Sie den Kontrast der überlagerten Bilder ein, indem Sie in das Kontrastfeld unter Bild, Anpassungen, Helligkeit/Kontrast 50 eingeben. Stellen Sie sicher, dass die Overlay-Bilder keine doppelt positiven FDA- und PI-Zellen enthalten.

Überlagern Sie für die FDA PI Hoechst-Dreifachfärbung die Bilder der Zellen, indem Sie erneut die FDA-positive Schicht auf die PI-positive Schicht ziehen, die Deckkraft der FDA-positiven Schicht anpassen und die Bilder wie zuvor zusammenführen. Ziehen Sie dann die Hoechst-positive Ebene auf die zusammengeführte Ebene.

Passen Sie die Deckkraft der Hoechst-positiven Ebene an, indem Sie 50 % in das Deckkraftfeld des Ebenenbedienfelds eingeben, und führen Sie die beiden Ebenen zusammen, indem Sie das Ebenenmenü öffnen und auf die Schaltfläche Sichtbare zusammenführen klicken. Unterscheiden Sie visuell zwischen großen, unregelmäßigen Gliazellen und zerebellären granulären Neuronen, indem Sie die im Fluoreszenzmodus aufgenommenen Bilder mit denen im Phasenkontrastmodus vergleichen.