Visualisierung von Pilzkörperneuronen in Drosophila-Gehirnen durch Immunfärbung

Wildtyp- und mutierte Drosophila-Gehirne werden in eine Lösung gegeben, die ein Fixiermittel und ein Detergens enthält. Inkubieren Sie mit leichtem Schaukeln.

Das Fixiermittel bewahrt die Morphologie des Gewebes, während das Detergens die Zellmembranen permeabilisiert.

Lassen Sie das Gehirn sich beruhigen und entfernen Sie dann die Lösung.

Waschen Sie die Taschentücher mit einem Puffer.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf ein spezifisches Protein abzielen, das die axonale Entwicklung in den Neuronen des Pilzkörpers (MB) des Gehirns reguliert.

Inkubieren, um die Antikörperbindung zu fördern.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die auf die Primärantikörper abzielen.

Waschen Sie erneut, um ungebundene Antikörper zu entfernen, und resuspendieren Sie das Gehirn dann in einem Einbettmedium.

Montieren Sie die Gehirne auf einen Brückenschlitten und visualisieren Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Im Vergleich zum Wildtyp weisen die mutierten Gehirne einen defekten Phänotyp auf, mit axonalen Fehlprojektionen und fehlenden MB-Lappen.

Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine P200-Pipette, um 10 bis 15 präparierte Gehirne desselben Genotyps in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das mit 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist, das in PTN verdünnt ist. Inkubieren Sie dann das Gehirn 20 Minuten lang unter langsamem Schaukeln bei Raumtemperatur. Lassen Sie das Gehirn nach der Fixierung am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie dann das Fixiermittel.

Führen Sie anschließend zwei Schnellwäschen mit 500 Mikrolitern PTN pro Waschgang durch. Tauschen Sie das PTN aus, sobald sich das Gehirn in der Röhre eingenistet hat. Führen Sie anschließend drei lange Wäschen mit PTN unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur durch.

Nach diesen Waschungen kann das Gehirn über Nacht bei 4 Grad Celsius in PTN gelagert werden. Nach dem Entfernen der letzten PTN-Wäsche inkubieren Sie das Gehirn mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und unter leichtem Rühren in 0,5 Millilitern Blocklösung. Nach dem Entfernen der Blockierungslösung fügen Sie die in Blockierungslösung verdünnten Primärantikörper hinzu und inkubieren Sie das Gehirn zwei Tage lang bei 4 Grad Celsius unter leichtem Rühren.

Entfernen Sie den primären Antikörper mit dem 5-Wasch-PTN-Waschregiment und tragen Sie dann die sekundären Antikörper auf. Lassen Sie diese Antikörper drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem Gewebe inkubieren, während Sie durch Schaukeln vor Licht geschützt sind.

Nach der Inkubation der Gehirne in der Sekundärantikörperlösung wenden Sie das PTN-Waschregiment an, indem Sie die Proben nach jedem Waschen mit Folie abdecken und zum Schluss so viel Puffer wie möglich entfernen. Fügen Sie als Nächstes 75 Mikroliter fluoreszierendes Eindeckmedium hinzu und lassen Sie das Gehirn und das Medium nur einmal in die Pipettenspitze hinein und wieder heraus. Das Rohr kann dann in Folie eingewickelt und mehrere Tage bei 4 Grad Celsius gelagert werden, im Idealfall wird jedoch direkt mit der Montage begonnen.

Um das Gehirn zu besteigen, baue eine Brückenrutsche. Positionieren Sie zwei Basis-Deckgläser im Abstand von etwa 1 Zentimeter auf einer positiv geladenen Folie. Stellen Sie sicher, dass die positiv geladene Folie nach oben zeigt. Kleben Sie dann die Deckgläser mit Fingernagellack auf die Folie und lassen Sie den Lack vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren.

Legen Sie dann den Objektträger unter ein Stereomikroskop und pipettieren Sie Gehirn und Medium in den Raum zwischen den Deckgläsern. Achten Sie darauf, die Beleuchtung anzupassen, um die Visualisierung des Gehirns zu verbessern.

Saugen Sie als Nächstes das überschüssige Montagemedium von der Rutsche ab und achten Sie darauf, das Gehirn zu vermeiden. Entfernen Sie dann die restlichen überschüssigen Einbettmedien. Dadurch können die Gehirne präziser positioniert werden.

Richten Sie nun mit einer Pinzette das Gehirn in einem Gittermuster aus, wobei die Antennenlappen nach oben zeigen. Lege dann ein Deckglas über das Gehirn und versiegele mit Fingernagellack die Kanten des oberen Deckglases, die an den Basisdeckgläsern befestigt sind. Beladen Sie nun den Mittelkavität tropfenweise mit frischem Einbettmedium, so dass das Medium durch Kapillarwirkung unter das Deckglas gezogen werden kann. Wenn der Hohlraum gefüllt ist, versiegeln Sie ihn vollständig mit klarem Fingernagellack.