JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:28 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie betäubte Zebrafischlarven in eine mit Agarosegel ausgekleidete Schale und stellen Sie sicher, dass das Gehirn für die Injektion nach oben zeigt.
Positionieren Sie die Schale unter einem Mikroskop, um die Hirnventrikel sichtbar zu machen, bei denen es sich um flüssigkeitsgefüllte Hohlräume im sich entwickelnden Gehirn handelt.
Nehmen Sie eine Mikroinjektionsnadel, die eine Lösung von Lipopolysacchariden oder LPS enthält, einer bakteriellen Komponente, um eine Immunantwort auszulösen.
Positionieren Sie die Nadel über dem Tectum des Gehirns, einer Region, in der sich Neuronen und ansässige Immunzellen, insbesondere Mikroglia, befinden.
Punktieren Sie das Gehirn mit der Nadel und injizieren Sie die LPS-Lösung in den Ventrikel.
Mikroglia im umgebenden Gewebe binden über Toll-like-Rezeptoren an LPS.
Die Bindung löst die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen aus, die Neutrophile an die Stelle rekrutieren, was zu Neuroinflammation führt.
Neutrophile erzeugen Ausbrüche von reaktiven Sauerstoffspezies und setzen proteolytische Enzyme frei, was zum neuronalen Tod führt.
Übertragen Sie die durch Neuroinflammation induzierten Larven in ein Kulturmedium, um sie für nachgelagerte Assays aufzubewahren.
Richten Sie den Mikromanipulator so ein, dass sich die Nadelspitze des Mikroinjektionsgeräts im gleichen Sichtfeld befindet wie die Larven bei hoher Vergrößerung. Eine Lösung von 2% Agarose in doppelt destilliertem Wasser in der Mikrowelle schmelzen. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Plastikschale. Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff, um die betäubten Larven in die Mitte einer mit 2 % Agarose beschichteten Kunststoffschale zu transportieren.
Richten Sie die montierten Larven mit der Gehirnseite nach oben aus, um den Zugang zur Nadel zu erhalten. Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die ventrikuläre Struktur des Gehirns des Zebrafisches im Gesichtsfeld deutlich dargestellt wird. Platzieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Hirntectum. Reinigen Sie den Gehirnbereich mit 70% Ethanol und stechen Sie die Haut des Zebrafischgehirns mit der Nadelspitze langsam mit dem Mikromanipulator ein.
Drücken Sie das Fußpedal, um einen Nanoliter 1X PBS oder verschiedene Konzentrationen von Lipopolysaccharid auszustoßen. Übertragen Sie die Larven unmittelbar nach der Injektion in ein sauberes E3-Medium.