Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung proliferierter neuraler Stammzellen in Hirnschnitten von Mäusen

Nehmen Sie fixierte Gehirnschnitte von Mäusen, die neuronale Zellen enthalten, einschließlich proliferierter neuraler Stammzellen, die mit EdU, einem Thymidin-Analogon, markiert sind.

Umranden Sie die Abschnitte mit einer hydrophoben Markierung, um eine Ausbreitung der Lösung zu verhindern.

Fügen Sie ein Reinigungsmittel hinzu, um das Gewebe zu permeabilisieren. Waschen, um überschüssiges Waschmittel zu entfernen.

Fügen Sie ein Fluorophor hinzu, um das EdU zu markieren. Entfernen Sie die überschüssigen Fluorophore.

Bestätigen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die korrekte Färbung der EdU-markierten Zellen.

Tragen Sie einen Blockierungspuffer auf, der Proteine enthält, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Entfernen Sie die überschüssigen Proteine.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die an bestimmte Proteine in neuralen Stammzellen binden. Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper hinzu, um die Primärantikörper zu binden. Waschen Sie die ungebundenen Antikörper ab.

Färbe die Zellkerne mit einem Farbstoff und entferne den überschüssigen Farbstoff.

Entfernen Sie die hydrophobe Markierung, bringen Sie Eindeckmittel auf und platzieren Sie ein Deckglas.

Beobachten Sie mit einem konfokalen Mikroskop die Schnitte, um die markierten neuralen Stammzellen sichtbar zu machen.

Um die Gewebeschnitte mit Thymidin-Analogon zu färben, entfernen Sie die Gewebeschnitte aus dem Citratpuffer. Lassen Sie die Gewebeschnitte trocknen und vollständig an den Objektträgern haften, bevor Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rand zeichnen. Anschließend permeabilisieren Sie die Schnitte 20 bis 30 Minuten lang mit Permeabilisierungspuffer. Waschen Sie die Abschnitte zweimal mit TBS Triton für jeweils 5 Minuten. Bereiten Sie dann eine EdU-Reaktionslösung vor.

Inkubieren Sie die Abschnitte 30 Minuten bis eine Stunde lang in EdU-Reaktionslösung. Waschen Sie sie anschließend dreimal jeweils 5 Minuten lang in TBS Triton. Überprüfen Sie zu diesem Zeitpunkt mit einem Fluoreszenzmikroskop, ob die EdU-Reaktion funktioniert. EdU-markierte Zellen sollten beobachtet werden, wenn die Reaktion funktioniert. Blockieren Sie nun die montierten Gewebeschnitte mit einem Blockierungspuffer, der im selben Tier wie der Sekundärantikörper gezüchtet wurde, für 30 Minuten bis zu einer Stunde. Waschen Sie sie dann zweimal jeweils 5 Minuten lang in TBS Triton.

Bereiten Sie während des Blockierungsschritts die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den primären Antikörper in einen Blockierungspuffer mischen. Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Objektträger hinzu, um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte vollständig untergetaucht sind, und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Waschen Sie am nächsten Tag die Gewebeschnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in TBS Triton, um überschüssige Primärantikörper zu entfernen.

Dann inkubieren Sie die Gewebeschnitte in Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die in einer Blockpufferlösung hergestellt wurden, für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Gewebeabschnitte dreimal für jeweils 5 Minuten in TBS Triton, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. Tragen Sie anschließend 300 mikromolare DAPI-Lösung in einer Dosis von 1 bis 100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf. Waschen Sie danach die Gewebeabschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS, um überschüssiges DAPI zu entfernen, und entfernen Sie den PAP-Stiftkreis um das Gewebe mit einem Wattestäbchen. Lassen Sie die Abschnitte trocknen, bevor Sie Eindeckmittel aufbringen und mit Deckgläsern abdecken.