Immunfärbung von kraniofazialen Geweben der Maus

Man nehme Kryoschnitte von fixiertem embryonalem kraniofazialem Gewebe der Maus, das aus Neuralleistenzellen besteht.

Waschen Sie die Schnitte in einem Puffer, der ein nichtionisches Detergens enthält, um das Einbettungsmedium zu entfernen und die Membranen zu permeabilisieren, um den Zugang zu intrazellulären Zielen zu ermöglichen.

Fügen Sie Blockierungslösung hinzu, um unspezifische Bindungsstellen zu sättigen.

Entfernen Sie die überschüssige Blocklösung. Inkubieren Sie dann mit primären Antikörpern, die auf nukleäre Antigene wie Transkriptionsfaktoren und Proliferationsmarker abzielen.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, um an die antigengebundenen Primärantikörper zu binden.

Entfernen Sie die ungebundenen Antikörper mit Puffer.

Fügen Sie ein Anti-Fade-Medium mit einem fluoreszierenden Kernfarbstoff hinzu und decken Sie es mit einem Deckglas ab.

Der Farbstoff färbt die Zellkerne, und das Anti-Fade-Medium schützt die Fluoreszenzsignale während der Bildgebung.

Bilde die Schnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Expression und Lokalisierung von Kernmarkern zu beurteilen, die auf die Proliferation von Neuralleistenzellen und die Signalaktivität hinweisen.

Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1 % PBST, um die OCT auszuwaschen und die Abschnitte zu permeabilisieren. Geben Sie 200 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Objektträger und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Blocklösung, ohne den Objektträger auszuspülen. Geben Sie 100 Mikroliter Primärantikörper in Blockierungslösung verdünnt zu jedem Objektträger und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur mit PBS aus. 100 Mikroliter Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungslösung, zugeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in PBS spülen, immer noch vor Licht geschützt. Um die Dias zu montieren, fügen Sie auf jeder Folie zwei Tropfen Anti-Fade-Medium mit DAPI hinzu. Mit einem Deckglas abdecken und bis zum Abbild bei 4 Grad Celsius lagern.