In-vitro-Bewertung von aggregiertem Amyloid-β auf den Kollaps des neuronalen Wachstumskegels

Beginnen Sie mit einem Multi-Well-Kulturobjektträger, der Neuronen eines Mausembryos in einem Medium enthält.

Die Neuronen weisen Wachstumskegel an den Spitzen ihrer wachsenden Axone auf. Zu diesen Strukturen gehören dünne Fortsätze, die als Filopodien bezeichnet werden, und blattartige Fortsätze, die Lamellopodien genannt werden und aus Aktinfilamenten und Mikrotubuli bestehen, Komponenten des Zytoskeletts.

Die Testvertiefungen werden mit aggregiertem Amyloid-β-Protein (Aβ) und die Kontrollvertiefungen mit einer Vehikellösung behandelt.

In den Testvertiefungen bindet aggregiertes Aβ an Membranrezeptoren und initiiert so eine nachgeschaltete Signalübertragung, die das Zytoskelett reguliert und Proteine phosphoryliert.

Die phosphorylierten Proteine stören Aktinfilamente und Mikrotubuli, wodurch die strukturelle Integrität des Wachstumskegels destabilisiert und sein Kollaps verursacht wird.

Inkubieren Sie mit einem Fixiermittel, um die Zellstruktur zu erhalten, waschen Sie dann die Zellen und montieren Sie sie für die Bildgebung.

Vergleichen Sie mit einem Mikroskop die zellulären Strukturen in den Test- und Kontrollvertiefungen.

Ein erhöhtes Auftreten von Wachstumskegelkollaps in Aβ-behandelten Neuronen deutet auf die toxische Wirkung von Aβ-Aggregaten hin.

Beginnen Sie diesen Assay mindestens eine Woche im Voraus, indem Sie ein frisches Fläschchen mit kommerziell hergestelltem A-beta-42 in voller Länge öffnen und den Inhalt in sterilem destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 0,5 Millimolar auflösen. Inkubieren Sie sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius, um Aggregation und Toxizität zu induzieren. Aliquots von aggregiertem A-beta-42 vorbereiten und bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Am vierten Tag der neuronalen Kultur behandeln Sie die Vertiefungen eine Stunde lang mit 100 Mikrolitern 0,5 mikromolar aggregiertem A-beta-42 oder Vehikellösung in Medium B, wie zuvor gezeigt. Entfernen Sie nach Ablauf der Stunde das Nährmedium und fixieren Sie die Neuronen sofort eine Stunde lang mit 4 % Paraformaldehyd und 4 % Saccharose in PBS bei 37 Grad Celsius auf einer heißen Platte.

Die Fixierung ist vor allem wichtig, da die Beibehaltung der Form der Wachstumszapfen für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung ist.

Waschen Sie die Neuronen nach der Fixierung dreimal mit PBS. Nachdem Sie die Kammer entfernt haben, mounten Sie die Neuronen mit einem wässrigen Einbettmedium. Trocknen Sie das Eindeckmedium zwei bis vier Tage lang bei 4 Grad Celsius. Erfassen Sie den gesamten Bereich jeder Vertiefung mit einer 20-fach trockenen Objektivlinse an einem inversen Mikroskop.

Das Erfassen und Analysieren des gesamten Bereichs in jedem Well ist wichtig, um Subjektivität zu vermeiden.

Klassifizieren Sie die längsten Neuriten jedes Neurons im Stadium 3 oder 4 als Axone. Axonale Wachstumszapfen, denen Lamellipodien fehlen oder die weniger als drei Filopodien besitzen, gelten als kollabierte Wachstumskegel.