Visualisierung von Amyloid-beta-Peptiden in kortikalen Hirnschnitten des Menschen

Nehmen Sie einen Objektträger, der eine kortikale Scheibe von Hirngewebe enthält, die von einem Alzheimer-Patienten entnommen wurde. Das Gewebe enthält unlösliche Amyloid-beta-Ablagerungen im Parenchym und in den Hirnkapillaren.

Tauchen Sie den Objektträger in verdünnten Alkohol, um Lipide und Salze zu entfernen.

Waschen Sie es mit absolutem Alkohol, um das Gewebe zu dehydrieren, und tragen Sie dann ein Fixiermittel auf, um die Gewebearchitektur zu erhalten.

Trocknen Sie den Objektträger vakuumtrocken und entfernen Sie jegliche Feuchtigkeit.

Behandeln Sie mit Ameisensäuredampf in einer befeuchteten Umgebung, um Amyloid-Beta-Aggregate in kleinere lösliche Peptide aufzuspalten.

Erzeugen Sie mit einem optischen Scanner Bilder der strukturellen Merkmale des Gewebes, um die Daten aus der bildgebenden Massenspektrometrie zu interpretieren.

Sprühen Sie eine Matrixlösung über die Probe.

Wenden Sie mit einem Massenspektrometer einen Laser an, den die Matrix absorbiert, um die Peptide zu ionisieren. Ein Detektor identifiziert sie dann anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses.

Analysieren Sie die Daten, um Bilder zu erstellen, die die Verteilung von Amyloid-Beta-Peptiden im Gewebeparenchym und in den Hirnkapillaren aufzeigen.

Um die Gewebeschnitte zu spülen, tauchen Sie die Proben 30 Sekunden lang in 40 bis 100 Milliliter 70%iges Ethanol in ein Glasfärbegefäß, um endogene Lipide und anorganische Salze zu entfernen. Waschen Sie die Proben in der Waschreihenfolge, die im Textprotokoll aufgeführt ist. Trocknen Sie die Proben dann 30 Minuten lang im Vakuum

.

Behandeln Sie nun die Gewebeschnitte mit einem Ameisensäuredampf für eine bessere Ionisierung der Amyloid-Beta-Proteine aus Autopsie-Hirngewebe. Bereiten Sie dazu den Backofen bei 60 Grad Celsius und eine Inkubationsglasschale mit 5 Millilitern 100% Ameisensäure vor. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit in der Inkubationsglasschale auf Sättigungsniveau.

Legen Sie die Gewebeobjektträger in die Inkubationsglasschale, vermeiden Sie ein Eintauchen in die Ameisensäure und behandeln Sie sie sechs Minuten lang. Nehmen Sie ein optisches Bild der Proben mit einem Filmscanner, Gelscanner oder einem Digitalmikroskop auf. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur durch.

Die Ausrichtung des optischen Bildes der Proben ist notwendig, wenn das Probentarget im Gerät platziert wird. In der Regel ist der Gewebeschnitt unterhalb der Matrixschicht nicht zu erkennen. Um die optischen Bilder mit den Proben zu korrelieren, machen Sie Hilfsmarkierungen, die sowohl im optischen Bild als auch unter der Matrixschicht in der Kameraoptik sichtbar sind. Am einfachsten ist es, vor der Aufnahme des optischen Bildes mindestens drei Korrekturflüssigkeitsmarkierungen um die Probe herum zu erkennen.

Um die Matrix mit einem Ultraschallsprühgerät zu besprühen, nehmen Sie das zu sprühende Gewebe aus dem Exsikkator und legen Sie es in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass das Taschentuch das Sensorfenster nicht bedeckt. Starten Sie die Vorbereitung, indem Sie die Starttaste drücken. Normalerweise beträgt die Vorbereitungszeit etwa 90 Minuten.

Die Aufbereitung wird automatisch über die Überwachung der Matrixschichtdicke und der Nässe geregelt. Alternativ können Sie zum Sprühen der Matrixlösung mit einem automatischen Sprühgerät ein Lösungsmittelpumpensystem verwenden, das auf 10 PSI und 0,15 Milliliter pro Minute eingestellt ist, um die Matrixlösung zu verabreichen.

Ein konstanter Strom von erhitztem Mantelgas wird zusammen mit dem Matrixlösungsspray zugeführt. Führen Sie mit MALDI-IMS Bildgebungsexperimente mit hohem Durchsatz und hoher räumlicher Auflösung durch. Für massenspektrometrische Messungen definieren Sie die Gewebebereiche mit der Steuerungssoftware MALDI und der Datenanalysesoftware.

Erfassen Sie Spektren in einem positiven linearen Modus mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 2.000 bis 20.000 und einer räumlichen Auflösung von 20 und 100 Mikrometern. Um den Kalibrierstandard herzustellen, lösen Sie den Peptidkalibrierstandard im Proteinkalibrierstandard im Verhältnis 1 zu 4 mit CHCA in TA30-Lösung auf und verdünnen Sie ihn dann 10-mal.

Platzieren Sie 1 Mikroliter Kalibrierstandard an vier verschiedenen Stellen auf dem Objektträger. Mit Hilfe von molekularer Histologie-Software können Sie mehrere Signalbilder überlagern, um die räumliche Korrelation verschiedener Signale zu finden, z. B. verschiedene Amyloid-Beta-Peptide, die in senilen Plaques in den Arterienwänden kolokalisiert sind.